TP DE MICROBIOLOGIE - ANNEE 2014-2015

Licence Sciences, Technologies, Santé mention Biologie

UE 5.5 b : Bactériologie Générale UE optionnelle du groupe B du semestre 5 - niveau L3 biologie

MATERIEL et Hygiène-Sécurité : Travail en binôme

Blouse propre en coton obligatoire Etuve : groupe du matin, étage du haut

Cheveux longs attachés groupe de l’après midi, étage du bas Pas de coiffure non facilement retirable

Pas de coiffure en matière inflammable

Signaler toute coupure aux doigts Pipetage uniquement avec poires

Pour le CR par binôme et les séances respecter les consignes de la dernière page

PROGRAMME DU TP : LE COURS ET LES TD DOIVENT ETRE COMPRIS

����Travail stérile

����Identification de 3 souches

����Identification présomptive de souches d’un mélange

- Techniques de base : - Travail stérile

- Etat frais et Coloration de Gram

- Ensemencement

- Isolement sur milieux gélosés sélectifs et non sélectifs

Identification bactérienne par l’étude des caractères métaboliques et antigéniques

I - TRAVAIL STERILE (J1, J2)

1) J1

A partir d’un bouillon Trypticase Soja (TS) de 10 mL (tube à essai), transvaser stérilement ≈

2 mL dans 5 tubes à hémolyse à l’aide d’une pipette Pasteur.

- 2 bouillons serviront au test de stérilité : les incuber 24h à 37°C.

- les 3 autres bouillons serviront pour l’identification des 3 souches (voir II).

2) J2 Les 2 bouillons non ensemencés sont-ils limpides ? Conclusion.

II - IDENTIFICATION DE 3 SOUCHES (J1, J2, J3)

Chaque binôme reçoit 3 souches isolées sur gélose TS en vue d’une identification.

1) J1

- Caractères morphologiques. Pour chacune des 3 souches, réaliser séparément :

- Gram (objectif x 100 à l’immersion). Dessiner la forme exacte (allongée, ovale,

ronde, incurvée, …). Préciser le groupement.

- Etude de la mobilité

- ensemencement d’un milieu semi-solide mannitol-mobilité : piqûre centrale avec 1 colonie.

- ensemencement d’un bouillon TS de ˜ 2 mL avec 1 colonie.

- Réisolement - Isoler à partir du bouillon TS ensemencé par 1 colonie chaque souche

sur une gélose TS bien séchée par la méthode des quadrants. Flamber entre chaque quadrant.

TP L3 UE 5.5b Page 1

2) J2

Etudier sur les 3 souches :

- Caractères morphologiques.

- étude de la mobilité :

- lecture du milieu mannitol-mobilité.

- état frais entre lame et lamelle à partir du bouillon TS (objectif x 40 à sec).

Comparer le groupement avec celui de J1 à partir du Gram. Notez-vous une différence ? Si

oui, pourquoi ? Quel est le groupement le plus valide ?

- étude macroscopique des colonies

- Métabolisme énergétique - TESTS à REALISER SUR LA MEME LAME -

- catalase : Déposer 1 goutte de H2O2 puis les colonies avec 1 pipette Pasteur.

- oxydase : Déposer 1 papier buvard avec 1 goutte de TMPD. Déposer les colonies

avec une pipette Pasteur à la limite de la goutte et du buvard sec. Le test est + si c’est la

colonie qui vire au rouge.

Etudier selon l’identification présomptive de la famille ou du genre :

- Caractères métaboliques - pour bacilles Gram -

Lecture de la fermentation du mannitol sur le milieu mannitol-mobilité ensemencé en J1.

Ensemencement d’une galerie d’identification simplifiée en tubes (voir fiches techniques) :

- milieu de Kligler-Hajna

- milieu de Clark et Lubs (pour réaction de RM et VP)

- milieu urée-indole de Ferguson

- recherche de la nitrate réductase sur mannitol-mobilité.

Ensemencement d’une galerie API 10S.

- pour staphylocoques (coques Gram +, catalase +)

Lecture de la fermentation du mannitol (cf. ci-dessus).

Recherche d’une DNAse : ensemencer une gélose à l’ADN.

Recherche d’une coagulase : agglutination de particules de latex sensibilisées par du

fibrinogène.

- pour streptocoques (coques Gram +, catalase -)

Lecture de la fermentation du mannitol (cf. ci-dessus).

Etude des caractères antigéniques (à faire éventuellement J3) :

1- réaction d’agglutination de particules de latex

sensibilisées par des anticorps spécifiques de chaque polyoside C de groupe A, B, C et D.

3) J3 - pour bacilles Gram -

Révélation et lecture de la galerie d’identification en tubes.

Test ONPG : uniquement si la bactérie est lactose - (voir milieu de Kligler-Hajna).

Révélation et lecture de la galerie API 10E.

Comparaison des résultats obtenus par les 2 méthodes.

- pour les staphylocoques

Révélation de la DNAse.

TP UE L3 5.5b Page 2

III - ETUDE D’UN MELANGE DE GERMES (J1, J2, J3)

Chaque binôme reçoit un bouillon TS renfermant un mélange de germes.

1) J1 - Etude morphologique

- Gram : mettre 2 gouttes de pipette Pasteur sur une lame.

�- présomption : types de germes présents (forme, groupement, Gram)

�- choix de milieux de culture sélectifs ou non pour l’isolement de ces bactéries

- Isolement sur milieux solides :

Sur des géloses séchées isoler le mélange

- sur milieu non sélectif (gélose TS) pour permettre la croissance de toutes les

bactéries

- sur milieu(x) sélectif(s) si nécessaire pour inhiber certaines bactéries :

- milieu de Chapman sélectif pour staphylocoques et microcoques

- milieu de Drigalski sélectif pour bacilles Gram- courants (entérobactéries,

Pseudomonas, Vibrion).

2) J2 - Voir la qualité des isolements.

- Lecture des milieux Chapman et Drigalski.

- Identification présomptive de chaque germe :

- Gram

- oxydase

- catalase

- type respiratoire : Lecture des géloses Viande Foie (VF).

VOIR clichés fournis essaie de faire tenir sur une ligne sinon mettre à la ligne

Les géloses VF ont été ainsi préparées. Les VF sont préalablement régénérées 20 min. au

bain-marie bouillant et ramenées à ˜ 55°C. Elles sont ensemencées avec une colonie sur toute

la hauteur du tube puis solidifiées immédiatement en passant le tube sous l’eau froide. Les VF

sont incubées 24h à 37°C. Le bouchon est légèrement dévissé pour laisser l’air pénétrer.

AUCUN AUTRE TEST à faire

3) J3 Finir les lectures des tests.

COMPTE RENDU par binôme : à rendre impérativement en J3 à la fin de la séance :

- Utiliser les fiches de CR qui vous seront distribuées en J1

- Venir impérativement en J1 avec une note sur :

- principe et mode de lecture des milieux TS, Chapman et Drigalski.

- principe et mode de lecture des milieux Kligler, Clark et Lubs, urée-indole

et du test de la recherche de la nitrate réductase.

- définition des entérobactéries.

- L’absence de ces notes en J1 sera sanctionnée

- Inclure ces notes au CR

NB : - Ne pas oublier le n° des 3 souches étudiées et la lettre du mélange.

TP UE L3 5.5b Page 3

FICHES TECHNIQUES de L3 - UE 5.5b de BACTERIOLOGIE GENERALE

COLORATION DE GRAM : à partir d’une colonie dissociée dans une très petite goutte d’eau COLORATION DE GRAM : à partir d’un bouillon : Déposer 1 goutte de bouillon non dilué

Réaliser un frottis sur une lame :

Sécher lentement. Flamber à l’alcool 100° (1 ou 2 gouttes).

Recouvrir la lame de violet de gentiane (1 min.). Vider.

Recouvrir la lame de lugol (1 min.). Vider. Rincer à l’eau.

Décolorer à l’alcool 100° : recouvrir la lame 15 s. d’alcool 100°. Rincer immédiatement à l’eau.

Recommencer cette décoloration si la lame n’est pas transparente.

Recouvrir la lame d’eau. Ajouter 4 gouttes de fuchsine (1 min.). Rincer à l’eau.

Sécher en tamponnant délicatement la lame avec un papier absorbant. Marquer la lame.

EMPLOI DU MICROSCOPE Nettoyer objectifs et oculaires au papier Joseph avant et après chaque utilisation. Ne pas coller les

yeux sur les oculaires. L’objectif x 40 ne doit jamais recevoir d’huile.

- Lames colorées Les bactéries sont tuées, fixées sur la lame et colorées.

Condensateur monté jusqu’à la lame si le microscope le permet. Diaphragme ouvert. Objectif x 100 à

immersion (avec huile). Pour la mise au point, l’objectif trempe dans la goutte d’huile. Nettoyer au papier Joseph après utilisation de l’objectif.

- Etat frais Les bactéries sont vivantes en bouillon.

Déposer une anse de bouillon entre lame et lamelle. Observer l’abondance, (la forme), le groupement

et la mobilité des bactéries.

Condensateur baissé si le microscope le permet. Diaphragme fermé. Objectif x 40 à sec (sans huile).

Pour la mise au point, l’objectif est à environ 1 mm au-dessus de la lamelle.

PENSER à RESPECTER les REGLES d’Hygiène et Sécurité : lavage des mains, désinfection, tri des

déchets, bec bunsen, …

PENSER à RANGER votre paillasse en fin de TP

TP UE L3 5.5b FICHE TECHNIQUE Page 4

TECHNIQUES D’ENSEMENCEMENT DES DIFFERENTS MILIEUX DE CULTURE - Milieux liquides Pour tous les milieux liquides, dissocier dans le liquide une colonie prélevée avec l’anse métallique.

ex : - bouillon trypticase-soja (TS)

- milieu de RM/VP (Clark et Lubs)

- milieu urée-indole de Ferguson

- Milieux solides - en boîtes de Petri. --> Isolement en quadrant.

- gélose TS (peptones, NaCl 5%, agar)

- milieu de Drigalski (peptone, lactose, bleu de bromothymol, cristal violet, sels biliaires, agar)

- milieu de Chapman (peptone, mannitol, rouge de phénol, NaCl 75 g/L, agar)

--> Faire une strie.

- gélose à l’ADN ( peptone, ADN, NaCl 5%, agar).

- en tube.

Milieu Ensemencement Bouchon

mannitol-mobilité Piqûre fermé

viande-foie Piqûre entrouvert

Kliger-Hajna strie sur la pente + piqûre du culot entrouvert

REVELATION ET LECTURE DES MILIEUX D’IDENTIFICATION

Milieu Chapman et Drigalski : lire le métabolisme des sucres

Autres milieux : Lecture

TP UE L3 5.5b FICHE TECHNIQUE Page 5

Milieu Test Réactif à ajouter test positif test négatif

Urée-indole uréase

indole

TDA

0

Kovacs

FeCl3

rouge

anneau rose

brun foncé

orange

jaune, beige

brun clair

Clark et Lubs RM

VP

rouge de méthyle

10 gouttes NaOH puis

10 gouttes α Naphtol

rouge

rose en 10’- tube

incliné

jaune

jaune, beige

Gélose à l’ADN DNAse HC1 halo clair

Mannitol-

Mobilité

Mannitol

Gazogène

Mobilité

0

0

0

jaune

bulle

épaisseur de la

gélose trouble

rouge

-

épaisseur de la

gélose limpide

TP UE L3 5.5b FICHE TECHNIQUE Page 6

TABLEAU D'INDENTIFICATION / IDENTIFICATION TABLE / PROZENTTABELLE /

TABLA DE IDENTIFICACION / TABELLA DI IDENTIFICAZIONE / QUADRO DE IDENTIFICACAO

% de réactions positives aprés 18-24 H à 35-37°C/ % of positive reactions after 18-24 hrs. at 35-37°C/

% der positiven Reaktionen nach 18-24 Std. bei 35-37°C/% de las reacciones positivas después

de 18-24 H a 35-37°C/% di reazioni positive dopo 18-24 ore a 35-37°C/

% de reacçoes positivas apos 18-24 H a 35-37°C

API 10 S V3.O ONPGGLU ARA LDCODC CIT H2S URE TDA IND OX NO2

97 100 95 0 86 87 0 2 0 92 0 99

51 100 99 0 99 75 81 1 0 1 0 99

98 100 99 0 100 0 0 0 0 100 0 99

90 100 94 0 0 75 65 1 0 1 0 98

0 99 1 99 100 1 94 0 0 99 0 99

76 95 80 98 56 1 3 4 0 70 0 99

74 99 90 0 32 1 0 2 0 50 0 98

100 99 99 15 0 0 0 4 0 0 0 99

99 99 99 98 99 84 0 2 0 0 0 99

99 98 98 0 95 56 0 0 0 0 0 99

100 100 100 0 100 0 0 0 0 0 0 99

99 99 99 1 93 94 0 1 0 0 0 99

60 99 75 100 98 40 0 5 0 0 0 99

99 99 96 78 2 90 0 40 0 100 0 99

99 99 99 72 0 90 0 60 0 0 1 99

2 97 1 5 96 2 1 99 91 97 0 88

100 100 80 0 0 28 0 0 1 0 0 85

96 100 99 0 0 68 0 0 0 100 0 85

1 96 1 1 98 57 83 99 98 2 0 93

0 100 0 0 0 1 15 100 100 0 0 99

0 97 1 0 1 31 83 98 99 94 0 99

1 99 1 0 0 70 0 94 99 88 0 98

1 99 2 0 0 91 0 15 100 98 0 99

97 100 99 96 97 50 96 0 0 1 0 99

0 99 0 97 97 4 70 0 0 0 1 99

0 100 100 100 1 0 33 0 0 0 0 99

0 100 99 0 100 0 5 0 0 0 0 99

0 100 68 75 99 0 85 0 0 0 0 99

4 100 94 92 95 74 85 0 0 3 0 99

0 99 0 98 0 0 8 0 0 0 0 99

94 100 98 70 99 85 0 5 0 0 0 99

94 100 19 98 95 97 0 28 0 1 0 95

95 99 95 97 43 87 1 0 0 99 0 99

26 99 40 0 0 0 0 0 0 20 0 99

41 100 98 0 74 0 0 98 0 49 0 98

85 97 0 0 58 0 0 99 0 0 0 98

77 98 29 0 0 13 0 96 0 0 0 95

96 98 61 50 0 50 0 0 0 85 99 98

95 99 0 100 100 0 0 1 0 99 99 99

0 99 19 98 75 61 0 5 0 99 100 47

97 98 1 82 92 56 0 1 0 99 100 96

0 86 75 0 0 54 0 0 0 0 0 3

20 0 0 0 0 14 0 92 0 70 99 20

70 0 0 0 0 20 0 0 0 81 100 6

0 30 11 0 0 68 1 15 0 0 99 14

1 7 8 0 0 54 1 4 0 0 98 48

0 6 1 0 80 83 90 1 0 0 100 96

96 46 17 0 0 30 0 92 0 0 96 1

60 1 0 48 0 76 1 0 0 0 4 26

Enterobacter aerogenes

Escherichia vulneris

Escherichia coli 2

Citrobacter braakii

Citrobacter koseri/amalonaticus

Escherichia coli 1

Edwardsiella tarda

Citrobacter freundii

Citrobacter farmeri

Hafnia alvei

Enterobacter cloacae

Enterobacter spp/Escherichia coli/Shigella sonnei

Enterobacter amnigenus

Pantoea spp 1

Morganella morganii

Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae

Klebsiella oxytoca

Proteus vulgaris

Proteus penneri

Proteus mirabilis

Pantoea spp 2

Salmonella choleraesuis

Salmonella arizonae

Providencia stuartii/alcalifaciens

Providencia rettgeri

Salmonella spp

Salmonella pullorum

Salmonella paratyphi A

Salmonella gallinarum

Serratia odorifera

Serratia marcescens

Serratia liquefaciens

Salmonella typhi

Yersinia pseudotuberculosis

Yersinia enterocolitica 2

Yersinia enterocolitica 1

Shigella spp

Vibrio vulnificus/cholerae

Vibrio alginolyticus/parahaemolyticus

Plesiomonas shigelloides

Aeromonas hydrophila

Pseudomonas aeruginosa/fluorescens/putida

Chryseobacterium meningosepticum

Chryseobacterium indologenes

Acinetobacter baumannii

Stenotrophomonas maltophilia

Sphingobacterium multivorum

Shewanella putrefaciens

Pseudomonas spp