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MÉCANISMES MOLÉCULAIRES IMPLIQUÉS DANS … · Les recherches entreprises à l’unité INSERM 99 (Hôpital Henri Mondor) ont pour objectif de caractériser les voies d’activation

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FLAMMARION

MÉDECINE

-

SCIENCES

ACTUALITÉS

NÉPHROLOGIQUES

2003

MÉCANISMES MOLÉCULAIRES IMPLIQUÉS DANS L’ACTIVATION LYMPHOCYTAIRE T

AU COURS DU SYNDROME NÉPHROTIQUEÀ LÉSIONS GLOMÉRULAIRES MINIMES

par

D. SAHALI, P. GRIMBERT, V. AUDARD, A. VALANCIUTÉ,S. LE GOUVELHO, R. SALOMON, P. REMY, A. BENSMAN,

G. GUELLAËN, P. LANG*

La néphrose lipoïdique est une entité anatomoclinique définie par un syndromenéphrotique pur et primitif, associé à des lésions glomérulaires minimes sansdépôts d’immunoglobulines ou de complément en immunofluorescence [1, 2]. Lesanomalies ultrastructurales consistent en un effacement des pédicelles, mais cetaspect témoigne d’une protéinurie massive sans préjuger de la cause. Il s’agit dela forme la plus fréquente de syndrome néphrotique idiopathique (SNI) qui inclutau moins deux autres syndromes caractérisés par des lésions d’hyalinose segmen-taire et focale ou de prolifération mésangiale [3]. Ces trois entités représentent 85-90 p. 100 des néphropathies glomérulaires de l’enfant et environ 20-30 p. 100 decelles de l’adulte [4-6].

Le Syndrome Néphrotique à Lésions Glomérulaires Minimes (SNLGM, néph-rose lipoïdique) et la forme immune de la Hyalinose Segmentaire et Focale (HSF)partagent plusieurs caractéristiques. Les deux entités ont une expression cliniquesouvent similaire, les perturbations immunologiques retrouvées dans le SNLGMont été également décrites dans la forme immune de HSF [7] et sont habituellement(SNLGM) ou souvent (HSF) sensibles à un traitement immunomodulateur (corti-coïde) parfois associé à un traitement immunosuppresseur (ciclosporine, ciclo-phosphamide, chloraminophène) [8]. Les lésions histologiques observées au coursde la HSF peuvent apparaître au cours de l’évolution du SNLGM résistant au trai-tement. Les glomérules sont optiquement normaux dans les récidives précoces de

* Hôpital Henri Mondor, Créteil.

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HSF après transplantation rénale même si cette lésion se développe constammentau cours de l’évolution dans les formes rebelles au traitement. Enfin et surtout,l’évolution et le pronostic du SNLGM et des HSF corticosensibles sont identiques.

Bien que le SNLGM puisse survenir à tout âge, l’incidence maximale estobservée entre dix-huit mois et huit ans. Dans la grande majorité des cas (85-90 p. 100), le SNI est corticosensible, mais des rechutes surviennent pour envi-ron 60 p. 100 des patients lors de la diminution des doses de corticoïdes et/oude l’arrêt du traitement. On parle alors de corticodépendance dont le seuil estdéterminé par la dose de corticoïde prise par le patient lors des rechutes. Chezles patients corticodépendants à bas seuil, l’introduction d’un agent immunomo-dulateur (lévamisole) permet de réduire la fréquence des rechutes et de maintenirune rémission sans accroître les doses de corticoïdes. En revanche, chez lespatients corticodépendants à haut seuil, il est souvent nécessaire d’augmenter lesdoses de corticoïdes et d’introduire des drogues immunosuppressives (ciclospo-rine ou ciclophosphamide) pour contrôler les rechutes. Les conséquences de cettestratégie ne sont pas anodines pour des enfants ou des adultes jeunes (HTA,retard de croissance, ostéoporose, cataracte, ostéonécrose, infertilité, troublesendocriniens, psychologiques, risque de prolifération maligne). Dans de rarescas, la rémission complète ne peut être obtenue, en dépit de traitements succes-sifs et les patients développent, après un délai variable, des lésions de gloméru-losclérose et évoluent vers l’insuffisance rénale chronique terminale. Le risquemajeur après la transplantation rénale est la récidive de la maladie sur le greffon.Il est estimé à 25-30 p. 100 lors d’une première transplantation, mais peut attein-dre 80 p. 100 lors d’une seconde greffe si la récidive a conduit à la perte dugreffon initial [9], en raison notamment d’une fréquence accrue d’épisodes derejets [10]. Les traitements de la récidive comportent l’utilisation de la ciclos-porine intraveineuse, des échanges plasmatiques, des immuno-adsorptions, éven-tuellement associés à une augmentation du traitement immunosuppresseur. Ilsentraînent souvent une rémission complète ou partielle mais malheureusementtransitoires [11-13].

IMMUNOPATHOGÉNIE DU SNLGM

L’approche génétique des formes familiales de HSF a permis une avancéedécisive dans la compréhension de certains mécanismes moléculaires qui régis-sent le fonctionnement de la barrière de filtration glomérulaire. En effet, cesétudes ont conduit à l’identification de gènes codant pour des protéines expri-mées par le podocyte et dont l’altération par mutation ou délétion partielleentraîne une rupture des interactions dynamiques entre le cytosquelette podo-cytaire et les diaphragmes de fente [14-16]. En dépit de ces avancées, l’étiologiedu SNLGM et de la forme immune de HSF reste une énigme [17]. L’absencede lésions inflammatoires et de dépôts de complexes immuns dans les gloméruleset la fréquente récidive de la maladie après transplantation suggèrent que le syn-drome néphrotique a une origine extrarénale [18]. Cette hypothèse est confortéepar des observations cliniques de résolution rapide du syndrome néphrotiquechez des receveurs ayant bénéficié de reins prélevés chez des donneurs atteintsde SNLGM [19] ou de HSF [20].

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GÈNES

ACTIVÉS

DANS

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Arguments cliniques en faveur d’une origine immune

Dans environ deux tiers des cas, la néphrose survient dans un contexte d’acti-vation du système immunitaire déclenchée par une infection banale (virose) ouune agression (piqûre d’insectes, vaccination). Un terrain atopique est observé chezenviron un tiers des patients. Les médicaments qui inhibent le système immunitaire(corticoïdes, immunosuppresseurs) contrôlent habituellement la maladie. Outre ceséléments, l’origine lymphocytaire T de la maladie est également suspectée surl’association, plus fréquente que dans d’autres glomérulopathies, des néphrosesavec certaines proliférations lymphoïdes malignes comme la maladie de Hodgkin[21], la leucémie à LGL (Lymphocyte T à larges granules) [22], des lymphomes T[23] et des thymomes [24], mais ces situations sont relativement rares.

Perturbations des fonctions lymphocytaires T dans les néphroses

Lors d’une stimulation antigénique, le système immunitaire développe uneréponse qui implique une action coordonnée entre les cellules présentatrices d’anti-gène et les lymphocytes T et B. Une altération possible des fonctions lymphocy-taires T à l’origine des néphroses a été évoquée, il y’a une trentaine d’années, àla suite de nombreuses observations cliniques et expérimentales [25]. En effet, lespatients atteints de SNI expriment souvent un déficit de l’immunité cellulaire quipeut expliquer l’apparente susceptibilité de ces enfants à développer des infectionsbactériennes [25]. Lors des rechutes, l’analyse par immunophénotypage des sous-populations lymphocytaires T périphériques retrouve une expansion des lympho-cytes T CD4

+

qui expriment le marqueur CD 25 [26], ainsi que des lymphocytesT CD4

+

et CD8

+

qui expriment le marqueur CD45RO caractéristique des lympho-cytes T mémoires [27]. L’expression de l’antigène CD25 (chaîne

α

du récepteurde l’IL-2), au cours des poussées, peut refléter une activation des cellules TCD4

+

ou bien traduire le recrutement d’une sous-population mineure (

10 p. 100)de lymphocytes T CD4

+

/CD25

+

, dotée de fonctions suppressives. Cette secondeéventualité est compatible avec certaines études fonctionnelles qui ont montré unediminution de l’immunité à médiation cellulaire, appréciée par des tests cutanésd’hypersensibilité retardée (type IV dans la classification de Gell et Combs) et uneréduction de la capacité des lymphocytes T à proliférer en présence de mitogènes[28, 29]. Le rôle spécifique des lymphocytes T suppresseurs dans les néphrosesreste à établir. Cependant, il est vraisemblable qu’une proportion majoritaire descellules T CD4

+

exprimant le marqueur CD25 correspond à des cellules T activéesau cours des néphroses. Les lymphocytes T CD8

+

semblent également recrutésdans la maladie, particulièrement chez les patients dont l’évolution est émaillée derechutes fréquentes, où il a été mis en évidence une restriction du répertoire avecune expression sélective de certaines familles de gènes V

β

qui forment la régionvariable CDR3 de la chaîne béta du récepteur T [30].

Cytokines et SNLGM

Une masse considérable de travaux a été consacrée à l’étude des profils de cyto-kines dans les néphroses avec une grande variabilité dans les résultats, liée aumoins à quatre biais dont certains sont difficilement contournables dans ce type

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de pathologie : i) il existe une dispersion considérable du niveau d’expressiond’une cytokine donnée d’un patient à un autre, lié à leur situation immunologiqueantérieure ; l’appariement des données (poussée

vs

rémission pour chaque patient)est donc un élément critique dans l’évaluation statistique des résultats ; ii) de nom-breuses études ont été accomplies sur des cellules stimulées

in vitro

qui ne tiennentpas compte des contraintes cellulaires et moléculaires qui prévalent

in vivo

; iii) lavariabilité des techniques de dosage, celles-ci devraient inclure pour chaque cyto-kine, la quantification des formes solubles du récepteur correspondant et éventuel-lement de ses antagonistes spécifiques ; iv) un tiers des patients présente un terrainallergique, ce qui fausse les conclusions d’une série à une autre en fonction dunombre variable de patients atopiques inclus dans les groupes. En dépit de cesréserves, il semble qu’une augmentation du TNF

α

, de l’IFN

γ

et de l’IL-13 soitplus souvent retrouvée au cours des néphroses (tableau I).

Hypothèse d’un facteur circulant

À la suite des premières observations de récidive du SNI après transplantationrénale, l’hypothèse d’un facteur de perméabilité altérant la barrière de filtrationglomérulaire a été postulée [18]. La propriété de certains surnageants de culture

TABLEAU I. — SYNTHÈSE DES DONNÉES DE LA LITTÉRATURE CONCERNANT LE NIVEAU

D’EXPRESSION DES CYTOKINES DANS LES NÉPHROSES. LES POINTS CORRESPONDENT AUX

DONNÉES RAPPORTÉES DANS LES PUBLICATIONS RÉFÉRENCÉES À DROITE DU TABLEAU.

CYTOKINE AUGMENTÉE DIMINUÉE INCHANGÉE RÉFÉRENCES

IL-1 • • • • • • [7], [34], [56], [57], [58], [59]

IL-2 • • • • • • [7], [34], [42], [58], [59], [60]

IL-4 • • • • • [7], [34], [42], [61]

IL-6 • [62]

IL-8 • • • • [7], [42], [60], [63]

IL-10 • [64]

IL-12 • • • [65], [66]

IL-13 • • [41], [42]

TNFα • • • [34], [58], [59]

IFNγ • • • [7] , [42], [60]

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GÈNES

ACTIVÉS

DANS

LE

SYNDROME

NÉPHROTIQUE

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de lymphocytes T de patients atteints de SNI d’induire une protéinurie chez le rat,suggère que ce facteur est produit par des cellules du système immunitaire [31-34]. D’autres arguments cliniques viennent renforcer cette hypothèse : i) la trans-mission maternofœtale transitoire du syndrome néphrotique [35] ; ii) les rechutesimmédiates du SNI après transplantation et leurs rémissions obtenues par échangesplasmatiques ou immuno-absorption du plasma [12, 36]. L’analyse récente parimmunochimie du matériel élué des colonnes d’immuno-absorption n’a pas permisd’identifier un facteur potentiel, mais semble indiquer que l’essentiel de l’activitéprotéinurique de l’éluat se trouve dans les fractions sériques de poids moléculaireapparent inférieur à 150 kDa [11, 36, 37].

L’existence d’un facteur de perméabilité circulant impliqué dans la physio-pathologie du SNLGM et de la forme immune de HSF est admise par de nom-breux auteurs, mais ce facteur reste une énigme quant à son origine, ses propriétésphysicochimiques et son mécanisme d’action.

Les recherches entreprises à l’unité INSERM 99 (Hôpital Henri Mondor) ontpour objectif de caractériser les voies d’activation lymphocytaire sélectivementrecrutées au cours du SNLGM afin de comprendre les mécanismes immunopatho-logiques opérant dans la phase aiguë de la maladie. Nous avons abordé l’étude duSNLGM à travers une approche moléculaire (clonage soustractif et différentiel)visant à identifier les gènes surexprimés ou induits dans le lymphocyte T au coursdes poussées. Compte tenu du rôle des protéines NF

κ

B dans la régulation des cyto-kines, nous nous sommes intéressés en parallèle à l’étude de cette voie qui joueégalement un rôle prépondérant dans la réponse immunitaire.

APPORT DU CLONAGE SOUSTRACTIF ET DIFFÉRENTIEL À L’ÉTUDE DES GÈNES IMPLIQUÉS DANS LA PHYSIOPATHOLOGIE

DE LA NÉPHROSE LIPOÏDIQUE

Dans la mesure où les poussées de SNI sont associées à une activation des lym-phocytes T, l’étude des gènes surexprimés et/ou induits dans ces cellules peutnous indiquer les voies d’activation recrutées et nous orienter vers des mécanismeseffecteurs potentiels. La démarche utilisée est illustrée dans la figure 1. Nousavons isolé les lymphocytes T d’un malade en phase de poussée et en phase derémission. Les ARN messagers isolés ont servi à construire une banque d’ADNcomplémentaires (ADNc). Nous avons ensuite réalisé une hybridation soustractiveentre les ADNc synthétisés à partir des lymphocytes T isolés à la phase active dela maladie (syndrome néphrotique) et les ADNc exprimés par les mêmes cellulesen phase de rémission (disparition de la protéinurie). La méthode de soustractiona été optimisée de telle manière que les ADNc présents dans les deux situationscliniques ou exprimés majoritairement en rémission puissent être éliminés. Auterme de la soustraction, seuls les ADNc spécifiquement induits lors de la phasenéphrotique ont été sélectionnés puis clonés dans un vecteur d’expression. Lesclones recombinants ont été analysés par criblage différentiel à l’aide de sondessynthétisées à partir d’ARN messagers de lymphocytes T de patients en phasenéphrotique (sondes positives) et de patients en phase de rémission (sondes néga-tives). En outre, afin d’exclure les gènes dont l’activation est une conséquence de

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l’état néphrotique, nous avons inclus dans les contrôles négatifs des sondes pro-duites à partir d’un syndrome néphrotique lié à une Glomérulonéphrite ExtraMembraneuse (GEM) dont les mécanismes physiopathologiques sont complète-ment distincts de ceux du SNI [38].

Cette approche nous a permis d’isoler 84 transcrits dont 42 correspondent àdes gènes de fonction connue, 12 à des gènes identifiés mais dont la fonctionest inconnue, et 30 sont des transcrits inconnus [39]. Parmi les gènes connus,dix-huit sont impliqués dans des voies de signalisation recrutées lors de l’acti-vation du complexe récepteur T. Nous avons montré que le niveau d’expressionde Fyb/Slap, Grancalcine et de la l-plastine, trois protéines impliquées dans laréorganisation du cytosquelette et la redistribution des intégrines dans le lym-

Néphrose lipoïdiquePBMC enrichis en lymphocytes T

Poussée(P)

ARNm

ADNc

ADNc (P)

Sondessoustraites (P-R)

Rémission(R)

ARNm

ADNc

GEM

ADNc (R)

Sondessoustraites (R-P)

Hybridation soustractiveenrichissement en ADNcsurexprimés et/ou induits

en poussée (P-R)

Criblage différentielde la banque soustraite

Gènes surexprimés et/ou induitsdans les néphroses lipoïdiques actives

FIG. 1. — Stratégie utilisée pour identifier les gènes surexprimés et/ou induits dans la néph-rose lipoïdique (clonage soustractif et différentiel).

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phocyte T, était élevé au cours des poussées et diminué en phase de rémission.Ce résultat constitue un support scientifique direct aux nombreuses observationscliniques suggérant que le lymphocyte T est un acteur essentiel de la maladie.Chez tous les patients analysés en poussée, en l’absence de tout traitement,l’expression du récepteur de l’IL-12 (spécifique des lymphocytes Th1) est répri-mée, ce qui suggère que le champ d’activation du lymphocyte T était orientéprécocement vers une voie Th2 [40], caractérisée par la production de cytokinescomme l’IL-13 [41, 42].

Plusieurs gènes connus, identifiés dans ce travail, sont des composants de lavoie NFκB ou sont impliqués dans la régulation de cette voie qui contrôle la trans-cription de nombreuses cytokines. Il s’agit de gènes codant pour l’IL-1β, Rantes,p38 Map kinase, Traf6, Macropain (sous-unité α2 du protéasome). Il est intéres-sant de noter que l’implication de la voie NFκB et du protéasome, dans les néph-roses, a été mise en évidence par deux approches radicalement différentes etindépendantes.

Le séquençage systématique des clones issus de l’hybridation soustractive àrévélé, de façon inattendue, la présence d’un nombre important d’ARN messagersgénérés par épissage alternatif inhabituel de gènes impliqués dans des fonctionsdiverses : facteurs transcriptionels, cytokines, gènes impliqués dans l’organisationdu cytosquelette et la transmission de signaux. Ces données ont été secondairementconfirmées sur une cohorte de patients atteint de SNLGM. Elles pourraient sug-gérer que des anomalies d’épissage et/ou des erreurs dans la maturation des ARNmpuissent jouer un rôle dans la physiopathologie de la maladie (Grimbert et coll.,manuscrit soumis).

ACTIVATION TRANSCRIPTIONNELLE DANS LES LYMPHOCYTES T

AU COURS DU SNLGM

Dysrégulation de la voie NFκB/IκBα au cours du SNLGM

La néphrose lipoïdique est associée à une production accrue de certaines cyto-kines dont l’induction transcriptionnelle est en partie contrôlée par la voie NFκB/IκBα. La famille des protéines NFκB/Rel comporte chez l’homme cinq membres,NFkB1 (p50), NFkB2 (p52), cRel, RelB, et RelA (p65) qui forment des homos etdes hétérodiméres variables selon le type cellulaire et la nature des agents induc-teurs [43]. Les protéines NFκB sont négativement régulées par les membres de lafamille IκB (IκBα, IκBβ, Bcl3). Les protéines IκBα, et IκBβ, interagissent avecRelA (p65) tandis que Bcl3 se lie aux homodimères p50. Dans les lymphocytes Tinactivés, l’hétérodimère principal NFκB p50/p65 est séquestré dans le comparti-ment cytoplasmique par son inhibiteur IκBα. L’activation de NFkB requiert doncl’élimination de l’inhibiteur IκBα. La phosphorylation au niveau de résidus sérinesen position 32 et 36 de IκBα par action de IκKα et IκKβ (pour IκB kinase α et β)permet le recrutement d’une ubiquitine ligase qui fixe des molécules d’ubiquitineau niveau de résidus Lysine 21 et 23 de IκBα. Cette modification constitue unsignal de reconnaissance pour la dégradation de IκBα par le protéasome, libérant

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ainsi le complexe NFκB qui migre dans le noyau, se lie à ses éléments de réponseprésents sur les promoteurs des gènes cibles dont il active la transcription. Ce sys-tème est doté d’un rétrocontrôle strict puisque le complexe NFκB induit égalementson propre inhibiteur IκBα, qui en retour bloque cette activation (boucle de rétro-régulation négative).

Nous avons montré que la voie NFκB était fortement activée dans les lym-phocytes T CD4 + au cours des poussées de néphrose lipoïdique et réprimée enrémission [44]. De façon surprenante, l’activation de la voie NFκB persiste tantque la maladie est active alors que dans les situations physiologiques, elle estrapidement réprimée du fait du rétrocontrôle négatif, suggérant une rupture dela boucle de régulation, d’autant plus que l’expression de IκBα reste faible voireindétectable durant cette phase. Au cours des rémissions, la restauration duniveau d’expression de IκBα est associée à l’inhibition des protéines NFκB età la diminution de la production de nombreuses cytokines comme le TNFα,l’IL-13 et l’IFNγ. Puisque les promoteurs de nombreuses cytokines ne possè-dent pas de domaine de liaison aux glucocorticoïdes [45, 46], l’inhibition de lasynthèse des cytokines au cours des rémissions serait secondaire au blocage dela voie NFκB [47]. Les anomalies de la voie NFκB/IκBα ne semblent pas uneconséquence de l’état néphrotique puisque dans les glomérulonéphrites extra-membraneuses ou la perte protéique est d’intensité comparable, l’activité NFκBbasale est comparable à celle des lymphocytes T au repos. Ces anomalies sem-blent par contre spécifiques aux néphroses et ne résultent pas d’une activationliée à un processus infectieux puisqu’elles ne s’accompagnent pas d’une acti-vation concomitante des voies de signalisation dépendantes de l’interféron α et β[44]. Nous avons montré que deux mécanismes au moins contribuaient à cettedérégulation : i) une suractivation du protéasome mise en évidence par desexpériences de culture de lymphocytes T des malades avec un inhibiteur puis-sant du protéasome (MG132) ; ii) une dégradation accrue de l’ARNm codantpour IκBα, associée à un défaut de transactivation du gène IκBα [44]. Cheztrois patients (deux enfants et un adulte) ayant présenté un SNLGM résistantaux glucocorticoïdes mais devenant sensible après l’introduction de la ciclo-sporine, nous avons observé que l’activité NFκB impliquant les complexes p65/p50 restait importante lors de la corticothérapie seule mais s’éteignait sousciclosporine/corticoïde. L’analyse du promoteur de IκBα chez ces trois patients,ainsi que chez quatre autres patients corticosensibles, pour lesquels l’expressionde IκBα était indétectable lors des poussées, n’a pas révélé d’anomalies géni-ques. Ces résultats suggèrent que durant la phase active de la maladie, des méca-nismes additionnels sont impliqués dans l’activation persistante de la voie NFκB.

Certaines observations cliniques montrent que les corticoïdes seuls sont par-fois incapables de contrôler une poussée de SNLGM tandis que l’association àla ciclosporine permet d’obtenir une rémission [48]. Ces observations suggèrentque les mécanismes par lesquels la ciclosporine et les corticoïdes induisent desrémissions du syndrome néphrotique ne sont pas nécessairement similaires maisplutôt complémentaires. Cette hypothèse est confortée par des données expéri-mentales qui montrent que l’activation NFκB dans les cellules mononuclééespériphériques et les lymphocytes T des patients en poussée est inhibée ex vivopar le MG132 qui bloque la dégradation de IκBα par le protéasome [44], unedes cibles de la ciclosporine [49, 50]. En revanche, les corticoïdes agissent pardifférents mécanismes [47], notamment en induisant une transactivation accrue

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GÈNES ACTIVÉS DANS LE SYNDROME NÉPHROTIQUE IDIOPATHIQUE 257

du gène IκBα, contribuant ainsi à séquestrer le complexe NFκB dans le cyto-plasme et à éteindre cette voie d’activation [51, 52].

Induction sélective de c-maf au cours de la néphrose lipoïdique

Le clonage soustractif et différentiel a permis d’identifier c-maf, un proto-oncogène, membre de la famille des facteurs de transcription à fermeture Éclairà leucine, dont l’expression basale est très faible ou indétectable dans le lympho-cyte T normal. Nous avons montré par des techniques de retard sur gel, immu-noblots et par immunofluorescence, que c-maf est spécifiquement recruté aucours des néphroses lipoïdiques (Valanciuté et coll., soumis). Dans les lympho-cytes T CD4+, l’expression de c-maf est détectée dans le noyau (forme active)au cours des poussées et dans le cytoplasme (forme inactive) au cours des rémis-sions. Le niveau d’expression de c-maf en rémission reste élevé chez les patientsqui présentent des rechutes fréquentes. La seule cytokine connue régulée par c-mafest l’IL-4 [53]. Nous avons montré que l’IL-4 ne pouvait pas être le gène ciblede c-maf puisque le niveau d’expression de l’IL-4, étudié par RT-PCR quanti-tative, est très faible durant les poussées alors que c-maf est présent dans lecompartiment nucléaire et actif puisqu’il se fixe à ses éléments de réponse invitro (Valanciuté et coll., soumis). Compte tenu de l’activation concomitante desprotéines NFκB, nous avons recherché si les complexes p50/p65 pouvaient inter-férer avec la transactivation du gène de l’IL-4 par c-maf. Deux types d’expériencesont été accomplis pour tester cette hypothèse. Premièrement, nous avons montréque l’incubation en présence de MG132 (inhibiteur de la voie NFκB), des lym-phocytes T de patients prélevés en poussée entraîne une augmentation significa-tive de l’expression de l’IL-4, comparativement aux mêmes cellules incubées enprésence du milieu seul. Nous avons ensuite montré par des expériences de cotrans-fection dans une lignée de lymphocytes T (Jurkat) que la transactivation du pro-moteur du gène de l’IL-4 était induite lorsque ces cellules étaient transfectéesavec un vecteur d’expression contenant la séquence codante de c-maf, mais quecette induction était inhibée lorsque les lymphoctes étaient cotransfectés avec lesvecteurs d’expression de c-maf et NFkBp65. Ces résultats suggèrent que la trans-activation du gène de l’IL4 par c-maf est bloquée par l’hyperactivité NFκB aucours du SNLGM.

Des données fondamentales récentes ont montré que c-maf inhibe la polari-sation des lymphocytes T CD4+ helper vers la voie Th1 par un mécanisme indé-pendant de l’IL-4 mais les gènes impliqués dans ce processus demeurentinconnus [54]. La mise en évidence d’une surexpression de c-maf lors des pous-sées, ainsi qu’une inhibition de l’expression du récepteur de l’IL-12 [40], consti-tuent deux arguments importants suggérant que les poussées de néphroselipoïdique sont précocement associées à une polarisation des lymphocytes T mala-des vers la voie Th2. Ces résultats peuvent expliquer deux types d’anomaliessouvent rencontrés chez ces patients : i) un défaut de réponse aux tests cutanésd’hypersensibilité retardée ainsi qu’une susceptibilité accrue à certaines infec-tions bactériennes, deux propriétés qui requièrent des lymphocytes Th1 fonc-tionnels ; ii) une fréquence accrue des manifestations allergiques et des tauxélevés d’IgE par rapport à la population générale, traduisant une réponse effec-trice de type Th2.

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Caractérisation d’une nouvelle protéine, Tc-mip, impliquée dans la voie d’activation de c-maf

L’activation des lymphocytes T entraîne le recrutement séquentiel de protéi-nes qui coordonnent la transmission du signal engendré par la liaison de récep-teur T avec son ligand, jusqu’à la réponse immune caractérisée par l’inductionde facteurs de transcription spécifiques et de leurs gènes cibles. Selon le typede message, la réponse immune peut être positive (production de cytokines) ounégative. Certaines protéines se situent au carrefour de cette signalisation, entrele stimulus initial lié à l’activation du récepteur T et l’activation transcription-nelle en aval. L’un des gènes inconnus isolé dans ce travail code pour une nou-velle protéine appartenant à cette catégorie, que nous avons nommée Tc-mip(Truncated c-maf inducing protein). Le transcrit Tc-mip est produit par épissage del’ARN primaire codant pour le gène c-mip. Cet épissage supprime le premier exonqui code pour la partie N-terminale du domaine pleckstrine de la protéine c-mip.L’ARNmessager de Tc-mip, ainsi que la protéine ne sont pas présents chezl’individu normal ainsi que chez les patients atteints d’autres glomérulopathies,alors qu’ils sont fortement exprimés chez les patients suivis pour un SNLGM(Grimbert et coll., manuscrit soumis). L’ARNm est exprimé principalementdans les lymphocytes T CD4+ de type Th2. Des expériences de transfection avecun vecteur d’expression contenant la séquence codante de Tc-mip dans une lignéelymphocytaire T qui n’exprime pas Tc-mip (Jurkat), ont permis de démontrer quela proteine Tc-mip, simule les signaux membranaires qui sont normalementinduits par l’activation du récepteur T, en provoquant des phénomènes d’adhé-sion intercellulaire. Ce mécanisme est associé à une réorganisation du cytos-quelette avec redistribution de la l-plastine au niveau des caps et déclenche latranscription et la migration nucléaire du facteur de transcription c-maf. Laprotéine Tc-mip pourrait appartenir à la famille des protéines adaptatricescytosoliques qui interviennent dans la transduction de signaux proximaux àpartir du TCR. Tc-mip constitue la première protéine identifiée à ce jour, direc-tement impliquée dans la transmission de signaux conduisant à l’activation dec-maf.

CONCLUSION

Les mécanismes initiateurs de la néphrose lipoïdique sont vraisemblablementd’origine immunologique et impliquent une participation active du lymphocyte TCD4 Th2. Nous avons identifié des voies de régulation transcriptionnelles, NFκB/IκBα et c-maf/Tc-mip, qui sont spécifiquement recrutées au cours de la maladie.Les résultats obtenus permettent de proposer un schéma préliminaire d’activationdu lymphocyte T dans les néphroses avec des sites d’impact possibles des traite-ments habituellement utilisés (fig. 2).

L’activation concomitante de ces deux voies en particulier de NFkBp65 et c-mafn’est pas classique et cette dualité pourrait contribuer à la variabilité des profilscytokiniques rapportés dans la littérature.

La mise évidence d’une régulation spécifique dans la maladie de certains transcritscodant pour des protéines tronquées est une donnée nouvelle qui peut s’intégrer dans

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GÈNES ACTIVÉS DANS LE SYNDROME NÉPHROTIQUE IDIOPATHIQUE 259

un concept émergent de la physiopathologie de certaines maladies chez l’homme[55]. Collectivement, ces résultats offrent une base moléculaire à une hypothèseénoncée, il y a trente ans, postulant que la néphrose lipoïdique résulterait d’uneréponse immune anormale médiée par le lymphocyte T [25].

Infections

Allergènes Autres inducteurs(Hodgkin, stress)

Conflit immunologique

Activation des signaux proximaux dépendant du TCR(formes anormalement épisées ?)

Réorganisation du cytosquelette

Activation des facteurs de transcription

c-maf

?

Facteur de perméabilité

Syndromenéphrotique

IKBα NFKB

Glucocorticoïdes

Effecteurs Th2Lévamisole

Fonction Th1(immunité cellulaire)

Tc-mip

Vaccins

Protéasome

Réponse T anormale

?

ciclosporine

FIG. 2. — Réponse immune au cours des néphroses : mécanismes possibles.effet activateur effet inhibiteur

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Remerciements

Les auteurs expriment leur profonde reconnaissance à Monsieur le ProfesseurGabriel Richet qui a permis à ce projet de naître et a constamment suivi et encou-ragé son développement.

Ce travail a bénéficié d’un financement de l’Académie Nationale de Médecineet des laboratoires Novartis. Il n’aurait pu s’accomplir sans la contribution de nom-breux services de néphrologie pédiatrique, particulièrement les services de Trous-seau (Pr A. Bensman), de Necker-Enfants Malades (Pr P. Niaudet), Robert Debré(Pr C. Loirat), du CHU Amiens (Pr Boudailliez), Rangeuil-Toulouse (Dr Bouis-sou), ainsi que des services de néphrologie adulte de Henri Mondor (Pr P. Lang),Necker (Pr JP. Grunfeld) et Bicêtre (Pr A. Charpentier).

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