Mémoire MASTER ACADEMIQUE Thème Contribution à l'étude de

UNIVERSITE KASDI MERBAH, OUARGLA

FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE

ET SCIENCES DE LA TERRE ET DE L'UNIVERS

DEPARTEMENT DES SCIENCES AGRONOMIQUES

Mémoire

MASTER ACADEMIQUE

Domaine: Sciences de la nature et de la vie

Filière: Biologie

Spécialité: Microbiologie appliquée

Présenté par: DECHACHE Aicha

MOFRADJ Zitouna

Thème

Soutenu publiquement

Le : 09/06/2014

Devant le jury:

Président: KHALLEF Sakina M.A.A UKM Ouargla

Encadreur: SIBOUKEUR Oumelkheir Professeur UKM Ouargla

Co-encadreur: SIBOUKEUR Amina M.A.B UKM Ouargla

Examinateur: BOURICHA M'Hamed M.A.B UKM Ouargla

Examinatrice: BALLA Asma M.A.B UKM Ouargla

Année université: 2013/2014

Contribution à l’étude de conservation d'une souche de lactocoques

isolée à partir du lait caprin

Remerciements

Avant tout, nous remercions Dieu le tout puissant, le Miséricordieux, de nous avoir

donné le courage, la force, la santé et la persistance.

Nous remercions notre promotrice Professeur SIBOUKEUR Oumelkheir et Mme

SIBOUKEUR Amina Maître

Assistante B du Département des Sciences Biologiques ; Faculté des Sciences de la

Nature et de la Vie, Université Kasdi Merbah d’Ouargla, pour l’honneur qu’elles

nous ont fait en dirigeant ce travail, pour leurs aide, leurs conseils, tout au long de

l’élaboration de ce modeste travail

A Mme KHALLEF Sakina Maitre Assistante A, du Département des Sciences

Biologiques ; Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie, Université Kasdi

Merbah d’Ouargla, nous adressons nos remerciements les plus sincères pour

l’honneur qu’elle nous fait en acceptant de présider ce jury.

A Mr. BOURICHA M’Hamed et Melle BALLA Asma, Maitres-assistants B, du

Département des Sciences Biologiques ; Faculté des Sciences de la Nature et de la

Vie, Université Kasdi Merbah d’Ouargla pour l’honneur qu’ils nous font en

acceptant de bien vouloir juger ce travail.

A Mr. Le Professeur CHEHMA Abdelmadjid, Directeur du Laboratoire Bio-

ressource, nous adressons notre profonde gratitude pour nous avoir permis d’accéder

à son laboratoire.

Au personnel des laboratoires, surtout Mr. BEGARI El Aich, Premier Responsable

des laboratoires pédagogiques, Mme KACI Safia, Magister en Sciences

Agronomiques et Melle KHAMGAOUI Amina Responsable du laboratoire

pédagogique de microbiologie, nous adressons notre profonde reconnaissance pour

leur soutien et leur infini gentillesse.

Que Mesdemoiselles SOUID Wafa et BOUDERHEM Amel, Maitres- Assistantes du

Département des Sciences Biologiques ; Faculté des Sciences de la Nature et de la

Vie, Université Kasdi Merbah d’Ouargla trouvent ici l’expression de notre gratitude

pour leurs conseils et orientations.

Enfin, nous remercions, tous ceux qui de près ou de loin, ont contribué à la

réalisation de ce travail.

Dédicace

Grace à Allah …

Je dédie ce modeste travail à :

Ma chère mère Massaouda, pour l’affection et l’amour qui m’ont donné le

courage et la force dans les moments les plus difficiles.

Mes chères sœurs : Nissa, Fatima, Fatiha, Sarah, sans que j’oublie mes deux

nièces : Randa et chaima

Mon frère unique : Mohammed

Toutes mes amies, surtout ; Zekri Maria, Djalabi Fatima el-zohra, Boukhloua

Samia, Gharbal aldjia, et particulièrement, ma binôme Dechache Aicha.

J’aimerai bien leur dire : que suis très heureuse de passer tous ces années avec

eux, des liens crées, de nouvelles amitiés, ainsi que, pour tous les moments

passés ensemble et ceux encore à venir.

En fin je dédie ce travail à toute la promotion 2ème

Master Microbiologie

Appliquée 2014.

Zitouna

Dédicaces

Je dédie ce mémoire à :

Ma très chère mère : Halima ;

A mon père : Mohamed ;

A mes sœurs : Fatima, Dalila, Massaouda

A mes frères : Djamel, Aissa, Khaled ;

A ma belle binôme : Zitouna;A mon

A toute ma famille ;

A tous mes chers amis surtout : Meriem, Samiha

Aicha

Liste des abréviations

Ca Calcium

CPE Cryo-protecteur extracellulaire

°D Degré Doric

DO Densité optique

G+ GRAM positif

H2O2 Le peroxyde d'hydrogène

IgG Immunoglobuline G

IgM Immunoglobuline M

L(+)

L'acide lactique

Lc Lactococcus

OSCN- L'hypothiocyanate

P Phosphate

SCN Thiocyanate

T Température

TB Le taux butyreux

TP Le taux protéique

Liste des figures

Figures Intitulé page

1

Dégradation du glucose par les bactéries lactiques (De

ROISSART et LUQUET, 1994) 12

2 Procédure expérimentale 25

3 Etapes suivies pour conserver la souche isolée et purifiée 31

4

Courbe d'étalonnage de la souche 1 isolée sur gélose M17

36

5 Evolution de la biomasse conservée 20J à la T. ambiante 38

6

Evolution de la concentration bactérienne de la souche conservée à

la réfrigération 39

7

Evolution de la concentration bactérienne de la souche conservée à

la congélation sans cryo-protecteur 39

8

Evolution de la concentration bactérienne de la solution conservée

à la congélation avec cryo-protecteur Glycérol (10%) 40

9

Evolution de la concentration bactérienne de la solution conservée

à la congélation avec cryo-protecteur Saccharose (12%) 41

Liste des tableaux

N° Intitulé page

I Germes typiques de la flore du lait cru (JAKOB et al., 2009)

15

II Constitution des lots expérimentaux

30

III Caractéristiques physico-chimiques de l'échantillon de lait caprin 31

VI

Caractéristiques morphologiques, physiologiques et biochimiques

de la souche de lactocoque

35

V

Résultats [ ] de la biomasse bactérienne en % après 5 jours pendant

20jours.

37

Table des matières

Remerciements

Dédicace

Liste des abréviations

Liste des tableaux

Liste des figures

Introduction 01

Synthèse bibliographique

1.1 Généralités 03

1.1.1 Chèvre 03

1.1.2 Avantages de l'élevage caprin 03

1.1.3 Exigence de l'élevage caprin 03

1.1.4 principales races de l'élevage caprin algérienne 04

1.1.4.1 L'arabia 04

1.1.4.2 La Makatia 05

1.1.4.3 La chèvre du M'zab 05

1.1.4.4 La chèvre Kabyle (naine de kabyle) 05

1.1.4.5 La montagnarde des Aurès 05

1.1.5 La production laitière caprine 05

1.2 Le lait de chèvre 06

1.2.1Compositions et propriétés physic-chimiques du lait 06

1.2.2 Propriétés médicales 07

1.2.2.1 Immunoglobulines 08

1.2.1.2 Lactoferrine 08

1.2.2.3 Lactoperoxydase 08

1.2.3 Technologiques fermière du lait caprin 09

1.3 Bactéries lactiques 10

1.3.1 Définition et caractéristiques des bactèries lactiques 10

1.3.2 Applications des bactéries lactiques 13

1.3.3 Propriétés fonctionnelles et technologiques recherchées 13

1.3.3.1 Activité acidifiante 13

1.3.3.2 Production de métabolites d'intérêt 14

1.3.3.3 Propriétés enzymatiques 14

1.3.3.4 Propriétés spécifiques aux probiotiques 14

1.3.3.5 Critères de performance 14

1.3.4 Microbiologie du lait chèvre 14

1.3.5 Caractéristique de Lactococcus lactis 16

1.3.5.1 Habitat 17

1.3.6 Utilisation industrielle des ferments lactiques 17

1.3.7 Avantages de l’utilisation des ferments concentrés 18

1.4 Conservation et formes commerciales des ferments lactiques 18

1.4.1 Congélation 18

1.4.2 Réfrigération 19

1.5 Cryoprotection des bactéries lactiques 19

1.5.1 Mécanisme d’action des cryoprotecteurs 20

II- Matériel et méthodes

2.1 Matériel d’étude 22

2.1.1 Lait de chèvre 22

2.1.2 Milieux de culture 22

2.1.2.1 Milieu d'isolement, purification (M17) 22

2.1.2.2 Milieu de conservation 22

2.1.3 Appareillage 22

2.1.4 Petit materiel 23

2.1.5 Produits chimiques et réactifs 23

2.2 Méthodes analytiques 23

2.2.1 Analyses physico-chimiques du lait 23

2.2.1.1 Mesure du pH 23

2.2.1.2 Acidité Dornic 23

2.2.1.3 Densité 23

2.2.2 Analyses microbiologiques 24

2.2.2.1Test de réductase 24

2.2.2.2 Isolement de la souche 26

2.2.2.3 Ensemencement dans un milieu sélectif 26

2.2.2.4 Pré-identification de la souche 26

2.2.2.4.1 Analyses préliminaires 26

2.2.2.4.1.1 Etude morphologique 26

2.2.2.4.1.1.1Observation macroscopique 26

2.2.2.4.1.1.2 Observation microscopique 27

2.2.2.4.1.1.2.1 Examen à l'état frais 27

2.2.2.4.1.1.2.2 Examen après double coloration de GRAM 27

2.2.2.4.1.1.2.3 Test de catalase 27

2.2.2.4.2 Pré-identification physico-chimiques et biochimiques 28

2.2.2.4.2.1 Tests physico-chimiques des souches 28

2.2.2.4.2.1.1 Croissance à différentes temperature 28

2.2.2.4.2.1.2 Tolérance à la salinité 28

2.2.2.4.2.1.3 Tolérance au pH alcalin 28

2.2.2.4.2.2 Tests biochimiques des souches 28

2.2.2.4.2.2.1Type fermentaire 28

2.2.2.4.3 Purification par repiquage successif 28

2.2.2.5 Propagation de la souche 28

2.2.2.6 Mesure de la croissance de la souche isolée 29

2.2.2.6.1 Mesure de la turbidité 29

2.2.2.6.2 Courbe d'étalonnage 29

2.2.3 Conservation des souches isolées 30

2.2.4 Suivi de la croissance par densité optique 30

III- Résultats et discussion

3.1 Qualité physico-chimique du lait 31

3.1.1 Mesure du pH 31

3.1.2 Acidité titrable 31

3.1.3 Densité 32

3.2 Analyses microbiologiques 32

3.2.1 Test de réductase 32

3.2.2 Test de catalase 32

3.3 Isolement, pré-identification et purification de la souche 33

3.3.1 Isolement de la souche 33

3.3.1.1 Observations macroscopiques 33

3.3.1.2 Observations microscopiques 33

3.3.2 Pré-identification de la souche 33

3.3.2.1 Caractéristiques morphologiques, microscopiques, physico-chimiques et

biochimiques des deux souches isolées 33

3.3.3 Purification 35

3.4 Propagation de la souche 36

3.4.1 Courbe d’étalonnage 36

3.5 Conservation de la souche isolée 36

3.5.1 Température ambiante 37

3.5.2 Réfrigération 38

3.5.3 Congélation sans cryo-protecteur 39

3.5.4 Congélation avec cryo-protecteur 40

3.5.4.1 Glycérol 40

3.5.4.2 Saccharose 41

Conclusion 42

Références bibliographiques 43

Annexes

Introduction

Introduction

1

Introduction

Le lait est un aliment de couleur généralement blanchâtre produit par les mammifères

femelles (KECHAOUI, 2013).

L'intérêt nutritionnel du lait réside dans sa richesse en nutriments de base (MOULEK,

2011), comme les protéines de qualité, contenant les acides aminés essentiels c'est-à-dire des

acides aminés que l'Homme doit se procurer par son alimentation car incapable de les

synthétiser lui-même (FICOW, 2010). Les lipides représentant une source importante

d'énergie, car ils sont métabolisés dans la mitochondrie des cellules qui récupèrent leur

énergie chimique pour synthétiser de l'ATP (DESJEUX, 1993), et les glucides. Le sucre

principal du lait est le lactose, c'est le composé prépondérant d e la matière sèche totale.

Le lait contient un certain nombre de minéraux. Leur concentration totale est inférieure à

1% du poids total. Les sels les plus importants sont les sels de calcium, de sodium, de

potassium, et de magnésium. Les sels de potassium et de calcium sont les plus abondants dans

le lait ordinaire (KEBCHAOUI, 2013). Le lait est également riche en vitamines A, B, D et

E, des vitamines liposolubles liées à sa matière grasse (FICOW, 2010).

En Algérie, il y a une spécialisation des zones Agro-écologiques en matière d'élevage. Les

parcours steppiques sont le domaine de prédilection de l'élevage ovin et caprin avec plus de

24 millions de têtes qui y vivent entrainant une surexploitation de ces pâturages. L'élevage

caprin vient en seconde position avec 4.7 millions de têtes, c'est-à-dire 14% comprenant 50%

de chèvres. Il se trouve concentré essentiellement dans les zones montagneuses, les hauts

plateaux et les régions arides (MAMI, 2013).

Le lait de chèvre est considéré comme étant l'un des plus complets et des mieux équilibrés

parmi les laits (AMROUN‐LAGA ET ZERROUKI, 2011).

Le lait est l'un des rares aliments qui convient pour les différentes tranches d'âge où il peut

être consommé tel quel à l'état frais ou transformé, notamment en fromage ou en yaourt

(MOULEK, 2011). Dans cette transformation, les bactéries lactiques composant la

microflore du lait cru, participe de façon importante à l'élaboration des caractéristiques

organoleptiques des produits laitiers fermentés. De nombreuses études montrent que les

produits laitiers préparés traditionnellement à partir du lait cru ont des saveurs typiques et des

qualités nutritionnelles de plus en plus recherchées par le consommateur (BALLA, 2011).

Les bactéries lactiques sont largement utilisées dans la fermentation de différents aliments.

Leur capacité à produire des acides organiques accompagnés de l'abaissement du pH est le facteur

majeur par lequel ces dernières inhibent la croissance des autres microorganismes concurrents

Introduction

2

D'autres métabolites tels que le peroxyde d'hydrogène, l’alcool et le diacetyl synthétisés par les

bactéries lactiques peuvent aussi contribuer à la conservation des produits agro-alimentaires.

L'existence d'un souchier au niveau d'une usine de transformation du lait permet d'assurer une

meilleure régularité des fabrications et une réalisation en routine de l'ensemencement direct

du lait. Il existe plusieurs méthodes de conservation des souches. Toutefois celles-ci affectent

souvent la viabilité des souches d'intérêt, en l'occurrence les souches acidifiantes et/ou les

souches aromatisantes, si certaines précautions ne sont pas prises. Parmi les nombreux

facteurs qui interviennent efficacement sur la survie des souches, l'addition de cryo-

protecteurs au milieu de conservation. Ces substances permettent aux cellules bactériennes de

mieux supporter les basses températures lors des traitements de conservation et/ou lors du

stockage (BALLA, 2011).

L'objectif de ce travail, vise à la conservation d’une souche de lactocoques isolée à partir

du lait caprin cru, en suivant les étapes:

Isolement de la souche sur milieu sélectif;

Pré-identification, par des tests physico-chimiques et biochimiques;

Repiquages successifs afin de la purifier;

Conservation de la souche dans un milieu de conservation sous différentes conditions:

T. (Température) ambiante (témoin), réfrigération, congélation sans cryo-protecteur, et

congélation avec cryo-protecteur (Glycérol 10% et Saccharose 12%).

I Synthèse bibliographique


3

1.1 Généralités

1.1.1 Chèvre

Les chèvres ont de tout temps joué divers rôles, dans la religion, l’économie, la nutrition,

les coutumes, et même l’habillement de l’Homme. Les chèvres ont ainsi été utilisées pour

différentes raisons, comme la production de lait, de viande, de fibres, de cuir…etc (DUBEUF

et al., 2004).

Elle appartient au genre Capra à la sous famille des Caprinés, de la famille des Bovidés. Ces

derniers dérivent du sous-ordre des ruminants, classe des mammifères pourvus d’un placenta

(sous classe Placentaires) et qui se regroupent dans l’embranchement des vertébrés du règne

animal (MANALLAH, 2012).

La chèvre domestique dont le nom scientifique est Capra hircus appartient:

Domestiquée, il y plus de 10.000 ans avant Jésus-Christ, la chèvre (Capra Hircus) est réputée

pour sa rusticité. C’est un animal adapté aux conditions rudes et à la sécheresse (SHKOLNIK

et al., 1980).

1.1.2 Avantages de l'élevage caprin

La chèvre représente pour le petit paysan un certain nombre d'avantages:

- Animal de petite taille ;

- Coût relativement bas ;

- Elevage comportant moins de risques ;

- Facile à nourrir ;

- Relativement plus féconde ;

- Adaptée aux régions arides et semi arides ;

- Résistante à certaines maladies (maladie du sommeil) (CARL et KEES VAN, 2004).

1.1.3 Exigence de l’élevage caprin

Le bien être et la productivité de la chèvre dépendent dans une large mesure de son

alimentation.


4

Une alimentation conforme doit :

Favoriser l’ingestion durant les phases aux besoins élevés, d’un fourrage de bonne

qualité ;

Adapter l’apport en nutriment et en minéraux aux différents phases du cycle de

production, telles que la gestation et la période d’allaitement ;

Permettre l’accès au pâturage dès que les conditions le permettent ;

Etre composée d’au moins 60% de la ration journalière en fourrage grossiers ;

Pouvoir améliorer le profil d’acides gras du lait et donc celui du fromage.

L’apport de l’herbe verte et du foin d’augmente la teneur en acides gras

polyinsaturé et diminue celle des acides gras saturés (LEGARTO et PALHIERE,

2013).

1.1.4 Principales races caprines algérienne

L'espèce caprine se présente en Algérie sous la forme d'une mosaïque de populations

très variées appartenant toutes à des populations traditionnelles. Elle comprend en plus de ces

populations locales, à sang généralement Nubien, des animaux mélangés aux sangs issus de

races standardisées. La population caprine d'Algérie renferme 05 types majeurs, l’Arabia, la

Makatia, la chèvre du M'zab, la chèvre Kabyle (naine de kabyle), la montagnarde des Aurès

(TEJANI, 2010).

1.1.4.1 L'Arabia

La plus dominante de ces populations est la chèvre arabe dite population Arabo-

maghrébine. Elle se localise en zones steppiques ou semi steppiques et présente un format peu

développé, brun foncé et dépourvue de corne. Au niveau phénotypique, elle manifeste des

caractères plus homogènes: Robe noire à long poils, pattes blanches au dessus du genou, raies

blanches et fauves sur le visage, tâches blanches à l'arrière des cuisses. Cet animal est

parfaitement adapté aux contraintes des parcours et semble posséder de bonnes aptitudes de

reproduction. La chèvre est principalement élevée pour la viande de chevreaux même si son

lait, produit en faible quantité, représente un intérêt indéniable (TEJANI, 2010).


5

1.1.4.2 La Makatia

Aux caractères assez hétérogènes, robe polychrome aux poils courts, oreilles

tombantes, elle semble être le produit de multiples croisements réalisés à partir de races

méditerranéennes. Elle est peu résistante sur les parcours et son intérêt réside dans sa

production laitière et son adaptation à l'environnement. Ces animaux sont également

saisonnés (TEJANI, 2010).

1.1.4.3 La chèvre du M'zab

Elle se trouve surtout dans le sud et serait un noyau de l'Ombrine qui est une bonne

laitière et très féconde. Cette race est très appréciée dans l'Est méditerranéen pour sa capacité

laitière et fait partie du rameau Nubio-Syrien (TEJANI K, 2010).

1.1.4.4 La chèvre Kabyle (naine de kabyle)

C'est une chèvre autochtone qui peuple les massifs montagneux de la Kabylie et des

Aurès. Elle est robuste et massive, de petite taille, de couleur noirâtre ou blanchâtre avec de

longs poils. C’est une mauvaise laitière et est appréciée plutôt pour sa viande (TEJANI,

2010).

1.1.4.5 La montagnarde des Aurès

C’est une chèvre qui ressemble au type de Kabylie. Elle est très appréciée pour la

quantité et la longueur de ses poils. Elle se distingue des autres populations par la longueur

des oreilles allongées, constituant une défense contre les effets de la sécheresse et par la

longueur des poils qui est à la base d'une industrie artisanale (TEJANI, 2010).

1.1.5 Production laitière caprine

Le consommateur recherche de plus en plus des produits particuliers en matière

d’origine et de goût. C’est pourquoi les produits à basede lait de chèvre sont très recherchés et

la production a fortement augmenté au cours de ces dernières années. Alors que de

nombreuses chèvres sont détenues en petits troupeaux et que leur élevage représente souvent

une activité accessoire, 20.000 tonnes de lait de chèvre au France, sont transformée chaque

année, en fromage et en d’autres produits à base de lait. Afin de pouvoir garantir la qualité et


6

la sécurité des produits, le besoin de méthodes simples et fiables pour la surveillance de la

qualité du lait de chèvre croît (WALTER, 2007).

1.2 Le lait de chèvre

Le lait de chèvre est un liquide blanc ou mât, due à l’absence de β-carotène

contrairement au lait de vache. Il a une odeur assez neutre. Parfois en fin de lactation, une

odeur caprine apparait et après stockage au froid il acquiert une saveur caractéristique

(BOSSET et al, 2000). Il donne une impression bien homogène c'est-à-dire ni trop fluide ni

trop épais. Du point de vue de ses qualités nutritives et digestives, le lait de chèvre possède

une bonne valeur nutritionnelle.

Ces qualités diététiques sont la conséquence d'un certain nombre de caractéristiques

physico-chimiques et microbiologiques (MONTEL, 2003).

1.2.1 Composition et propriétés physico-chimiques du lait

Le lait de chèvre a une composition et des caractères physico-chimiques particuliers

qui les différencient nettement du lait de vache (ABI AZAR, 2007). Le lait sécrété par les

différentes espèces de mammifères présentent des caractéristiques communes, et contient les

mêmes catégories de composantes : eau, matière grasse, lactose, minéraux et protéines

(CHILLIARD et SAUVANT, 1987).

Le pH du lait normal varie de 6,2 à 6,8. La majorité des laits ont un pH situé entre 6,4

et 6,6 et l'acidité entre 14 - 18° Dornic. Sa densité à 15°C est de l’ordre de 1.027-1.035 et son

point d’ébullition de l’ordre 100.5°C. Le point de congélation varie entre - 0,550 et - 0,583°C

(ANSART, 1995). Sa teneur en eau égale à 87% (AMIOT et al., 2002).

La matière grasse représente une source importante d’énergie. Elle se présente sous

forme de triglycérides, pauvres en acides gras polyinsaturés qui sont nécessaires au

métabolisme humain (TOUHAMI, 1996). Le lait caprin est aussi plus difficile à écrémer que

le lait de vache du fait que les globules gras caprins se démarquent par leur petite taille

(HOLMES et al, 1945 ; JEAN AMIOT et al., 2002). Il se caractérise par la présence,

d’acides gras à chaîne relativement courte (dont les acides caproïque et caprylique) qui

peuvent être absorbés par un mécanisme plus simple que celui des acides gras à chaîne longue

(DESJEUX, 1993).


7

Le lactose est le glucide le plus important du lait, d’autres glucides peuvent provenir

de l’hydrolyse du lactose (glucose, galactose). Certains glucides peuvent se combiner aux

protéines, formant des glycoprotéines ou peuvent se trouver sous forme libre (HOLMES et

al, 1945 ; AMIOT et al., 2002). Il constitue ainsi de source d’énergie et un apport de

galactose pour le développement du système nerveux central (MAHE, 1996).

Le lait de chèvre est moins riche en lactose, par rapport au lait humain (70g/l), avec

une variation allant de 40.6 à 42.7 g/l. Sa teneur en ce nutriment est proche de celle du le lait

de vache (44.13g/l) (MOUALEK, 2011 ; SIBOUKEUR, 2007).

Le lait contient tous les minéraux considérés comme essentiels pour la nutrition

humaine (KEBCHAOUI, 2013). La composition minérale du lait de chèvre est proche de

celle du lait de vache. Il est légèrement plus riche en Calcium (Ca) et phosphate (P) et

nettement plus riche en Magnésium, Potassium et Chlore (GUEGUEN, 1996).

Le lait de chèvre est pauvre en carotène et en acide folique (B9) (AMIOT et al.,

2002).

Le taux de caséine totale est un peu plus faible dans le lait de chèvre que dans le lait

de vache. Il représente 75% de matière protéique contre et 78 % dans le lait de vache (G

RICORDEAU, 1993 ; ABI AZAR, 2007 ; KEBCHAOUI, 2013).

De plus l'équilibre entre les différentes fractions caséiniques est très différent et se

caractérise par deux proportions 20 et 50 % de caséine Kappa et β alors qu'elle est de 13 et

34% dans le lait de vache (RICORDEAU, 1993 ; ABI AZAR, 2007 ; KEBCHAOUI,

2013). La taille moyenne des micelles du lait de chèvre est inférieure à celle du lait de vache

(HENNANE, 2011).

Le lait de chèvre est plus riche en protéines solubles que le lait de vache soit, 8.10

% contre 6.0 %. La β- lactoglobuline est la protéine majeure du lactosérum du lait caprin.

Elle représente environ 55% soit plus de 4.4g/l de lait contre 25% pour le lait bovin (FAO,

1998).

1.2.2 Propriétés médicinales


8

Le lait de chèvre est supposé porteur de vertus diététiques et thérapeutiques qui en font

un produit de qualité. Il aurait une meilleure influence sur la prévention de l’ostéoporose et

l’athérosclérose. Il préviendrait la prévention les inflammations des artères, et toutes les

maladies dans lesquelles le stress oxydatif joue un rôle : inflammations, vieillissement,

fertilité réduite chez l’homme, schizophrénie, cancer, maladies cardio-vasculaires. Les

oligosaccharides dans le lait de chèvre protègent contre les bactéries pathogènes dans les

intestins, et stimulent la croissance des bifido-bactéries dans le tractus gastro-intestinal

(FRANK, 2003).

Il existe également un nombre important d’espèces quantitativements mineures, dont

certaines jouent un rôle essentiel dans la protection du petit. C’est le cas des

immunoglobulines, la lactoferrine, la lactoperoxydase (DORA, 2007).

1.2.2.1 Immunoglobulines

D’une grande hétérogénéité, les immunoglobulines constituent un groupe protéique

complexe et différent significativement des autres protéines sériques (EIGEL et al, 1984).

Sur les 5 classes d’immunoglobulines seules les IgG, IgA et IgM se retrouvent dans le lait

caprin (PARK et al, 2007). La fonction protectrice de ces protéines, s’exprime à travers le

lait d’une part par la protection des glandes mammaires et d’autre part par celle du nouveau

né (DE WIT, 1998 ; MARSHALL, 2004).

1.2.2.2 Lactoferrine

Métallo glycoprotéine fixatrice du fer (HURLEY et al, 1993 ; MARSHALL, 2004),

la lactoferrine joue le rôle de promoteur dans l’absorption intestinale de celui-ci (HURLEY et

al, 1993). De plus, du fait de son homologie avec la transferrine, elle est souvent qualifiée de

lactotransferrine (VOJTECH et al, 2008).

Vu ses propriétés bactériostatiques (SHUSTER et HARMON, 1990), par

ferriprivation (MAYNARD et al, 1989), sa concentration dans le lait est un indice de

résistance des glandes mammaires à l’implantation d’une infection bactérienne (SHUSTER et

HARMON, 1990 ; RIBADEAU-DUMAS, 1991).

1.2.2.3 Lactoperoxydase


9

Enzyme la plus abondante du lait (RIBADEAU-DUMAS et GRAPPIN, 1989), la

lactoperoxydase est connue pour son caractère bactéricide du fait qu’elle est le catalyseur de

l’oxydation par le peroxyde d’hydrogène (H2O2) du thiocyanate (SCN) donnant naissance à

l’hypothiocyanate (OSCN-) (RIBADEAU-DUMAS et GRAPPIN, 1989 ; RIBADEAU-

DUMAS, et al, 1991). L’hypothiocyanate est un puissant antibactérien. Du fait de cette

caractéristique bactéricide, la lactoperoxydase est utilisée comme agent protecteur du lait cru

en particulier dans les régions tropicales (RIBADEAU-DUMAS et GRAPPIN, 1989).

1.2.3 Technologie fermière du lait caprin

Traditionnellement, la production fermière de fromages à partir du lait de chèvre se

base sur l’action des bactéries lactiques (LEFRILEUX et al., 2009). Ces dernières

interviennent dans de nombreuses transformations du lait en crème maturée, en laits

fermentés, en yaourts, en fromages frais et affinés (DESMAZEAUD, 1998).

L'ensemencement est assuré par le repiquage du lactosérum issu de la fabrication précédente

(technique de pieds de cuve) (LEFRILEUX et al., 2009). Le lait de chèvre est plus pauvre

en caséines que le lait de vache. Son rendement fromager est par conséquence plus faible. Ce

sont les spécificités de la composition de sa matière grasse qui donnent au fromage de chèvre

son goût caractéristique. Le lactose, et surtout les l’équilibre minéral (Ca, P), facteurs de

variations qui sont:la race et la conduite d'élevage (nutrition, reproduction, saisonnalité) sont à

l’origine des particulaires de ce lait (ZELLER, 2005). Même si un certain nombre de

recherches ont permis de faire le point sur les facteurs alimentaires influant par exemple sur le

taux butyreux (TB) ou le taux protéique (TP) du lait caprin, ainsi que leurs effets sur l'aptitude

à la coagulation, le lien entre l'alimentation des animaux et la composition azotée et minérale

du lait et des produits laitiers a fait l'objet de peu de travaux concernant cette espèce. A partir

de données collectées dans des exploitations caprines, un lien entre l'alimentation des chèvres

et le profil des courbes d'acidification en technologie lactique a été mis en évidence. La

présence d'urée en excès dans le lait de cette espèce a été suspectée dans l’apparition de

défauts de caillage en technologie lactique, ou dans un ralentissement de l’acidification en

technologie pâte pressée non cuite (LEFRILEUX et al., 2009). Il existe deux procédés de

fabrication du fromage de chèvre. Le plus répandu utilise des bactéries lactiques pour la

coagulation. C’est un procédé naturel, lent qui donne un caillé friable et perméable. L’autre

technique consiste à ajouter de la présure et on obtient assez rapidement un caillé ferme et

imperméable (ZELLER, 2005).


10

1.3 Bactéries lactiques

Bien avant que l'on soit conscient de l'existence des bactéries lactiques, elles avaient

été utilisées dans la conservation des aliments à base de lait, de viande, de poissons, de

légumes et de fruits (PAUL ROSSE et al., 2002). Pour trouver la cause de la coagulation acide

du lait, les chercheurs ont conclu que la présence de bactéries lactiques était responsable de

l’acidification du lait et de la maturation de la crème (De ROISSART et LUQUET, 1994 ;

VALERIE et al, 2003).

1.3.1 Définition et caractéristiques des bactéries lactiques

Les bactéries lactiques sont des cellules vivantes, procaryotes, hétérotrophes et

chimio-organotrophes. Elles forment un groupe hétérogène composé de coques et de bacilles,

dont la principale caractéristique est la production d'acide lactique à partir de la fermentation

des sucres. Non pathogènes, à quelques exceptions près, la majorité de bactéries lactiques ces

sont GRAM positives (G+), immobiles, asporulée. Elles sont anaérobies facultatives mais

aérotolérantes. Elles ne produisent pas de catalase mais certaines souches possèdent une

pseudo-catalase. Elles sont nitrate réductase, et cytochrome oxydase négative. Elles

colonisent des milieux naturels variés tels que la surface des végétaux et les muqueuses des

mammifères (intestin, bouches, vagin et surface de la peau). Elles ont des exigences

nutritionnelles nombreuses (acides aminés, peptides, sels, acides gras et glucides) (HOGG,

2005; BADIS et al., 2005).

Les bactéries lactiques sont largement utilisées dans la fermentation de différents

aliments. Leur capacité à produire des acides organiques responsables de l’abaissement du pH

leur permet d’inhiber la croissance des autres microorganismes concurrents. D’autres

métabolites tels que le peroxyde d’hydrogène, l’alcool et le diacetyl synthétisés par les

bactéries lactiques peuvent aussi contribuer à la conservation des produits alimentaires par

l’inhibition de la croissance de la flore indésirable.

De plus ces dernières peuvent synthétiser des composés inhibiteurs de nature

protéique appelés bactériocines (SIBOUKEUR, 2011 ; SOUID, 2011).

Toutes les bactéries lactiques ont un métabolisme fermentaire strictement

saccharolytique qui, en utilisant les glucides, peuvent produire soit de:


11

- L'acide lactique exclusivement (bactéries homolactiques strictes), (Fig.1)

- L'acide lactique et de l'acide acétique (bactéries hétérolactiques facultatives),

- L'acide lactique, de l'acide acétique ou de l'éthanol et de CO2 (bactéries

hétérolactiques strictes) (VANDAMM et al., 1996). (Fig.1)

Certaines espèces ou certaines souches peuvent en outre produire de l'acide formique

ou de l'acide succinique.

Parmi les nombreux genres de bactéries lactiques (Aerococcus, Alloiococcus,

Atopobium, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Oenococcus,

Pediococcus…) le genre Lactococcus joue un rôle important dans l’industrie agro-

alimentaire.

Toutefois, il est important de souligner, l’appartenant du genre Bifidobacterium aux

bactéries lactiques du fait de son effet probiotique et de son utilisation dans le secteur

alimentaire.


12

Figure 1 : Dégradation du glucose par les bactéries lactiques (De ROISSART et

LUQUET, 1994


13

1.3.2 Applications des bactéries lactiques

Les bactéries lactiques présentent des activités métaboliques assez diversifiées et une

capacité d'adaptation à différents environnements (SALMINEN et VON WARTGHI, 2012).

Cette diversité est responsable de leur large gamme d'applications à l'échelle industrielle.

Dans l'industrie alimentaire, ces microorganismes permettent la conversion d'une grande

variété de matières premières, conduisant ainsi à de nombreux produits. Les saucissons, les

laits fermentés et les fromages représentent des produits fabriqués à partir de matières

premières d'origine animale, tandis que la choucroute, les olives et certains vins (fermentation

malolactique) sont des exemples de transformation de matières premières d'origine végétale.

Parmi ces applications, l'industrie laitière est, sans doute, le plus grand consommateur de

ferments lactiques commerciaux, pour la production de laits fermentés, fromages, crèmes et

beurres (EGON, 2002). La fermentation du lait par les bactéries lactiques est à l'origine d’un

nombre important de produits différents, chacun possédant des caractéristiques spécifiques

d’arôme, de texture et de qualité (MAYRA-MAKINEM et BIGRET, 1998). Les bactéries

lactiques sont également utilisées dans l'industrie chimique (production d’acide lactique),

dans le domaine médical (notamment pour le traitement de dysfonctionnements intestinaux)

et dans l’industrie des additifs alimentaires (production d'exo polysaccharides et de mannitol)

(RUAS-MADIEDO et al., 2002 ; WISSELINK et al., 2002). Elles sont aussi utilisées pour

la production de bactériocines (RODRIGUEZ et al., 2003), et pourraient être impliquées

dans la production de protéines thérapeutiques ou comme vecteurs de vaccins (LANGELLA

et al., 2001).

1.3.3 Propriétés fonctionnelles et technologiques recherchées

L’utilisation des bactéries lactiques pour une application industrielle donnée, est

déterminée par leurs propriétés fonctionnelles et technologiques, telles que l’activité

acidifiante, la production de métabolites d’intérêt, et propriétés enzymatiques.

1.3.3.1 Activité acidifiante

La transformation du lactose ou d’un autre sucre assimilable en acide lactique, conduit

à l’acidification du produit. Cette acidification accroît sa durée de vie en limitant sa

contamination par les microorganismes d’altération ou pathogènes (FRANK et HASSAN,

1998 ; MAYRA-MAKIEN et BIGRET, 1998).


14

1.3.3.2 Production de métabolites d’intérêt

Selon les espèces et selon les souches, les bactéries lactiques sont capables de

produire des métabolites tels que l’acide acétique, l’éthanol, des arômes (diacétyle,

acétaldéhyde…), des bactériocines (activité antimicrobienne), des exo-polysaccharides, des

enzymes (protéases, peptidases, lipases…) et du CO2 responsable de la formation

d’ouvertures dans les fromages (MAYRA-MAKIEN et BIGRET, 1998; FRANK et

HASSAN, 1998 ; BEAL et al., 2008).

1.3.3.3 Propriétés enzymatiques

Les activités protéolytiques et peptidasique sont importantes car elles déterminent la

capacité des bactéries lactiques à utiliser la fraction azotée du milieu. L’activité lypolytique

présente, de plus, un intérêt pour les applications fromagères (BEAL et al., 2008).

1.3.3.4 Propriétés spécifiques aux probiotiques

En plus des activités précédentes, les souches probiotiques doivent être résistantes aux

acides gastriques et aux sels biliaires rencontrés lors de leur passage dans l’estomac, le

duodénum et l’intestin (DORA ANGELICA., 2007 ; OUWEHAND et al., 2002 ;

NOUSIAINEN et al., 2004).De plus, elles présentent des propriétés thérapeutiques

spécifiques à chaque souche, principalement en termes d’activités immunostimulantes et anti-

diarrhéiques.

1.3.3.5 Critères de performance

Indépendamment de la propriété fonctionnelle envisagée, les bactéries lactiques

doivent être résistantes aux bactériophages, aux traitements mécaniques, à la congélation et ou

à la lyophilisation. Elles doivent également être tolérantes aux inhibiteurs de croissance (tels

que l’antibiotiques, l’acidité, l’éthanol, le chlorure de sodium) (BEAL et al., 2008).

1.3.4 Microbiologie du lait chèvre

Des analyses microbiologiques de lait de chèvre, ont montré que les genres bactériens

rencontrés étaient représentés par six genres de bactéries lactiques: Lactobacillus,

Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Weissella, et Pediococcus. Les espèces de

Lactobacillus et Lactococcus dominent cette microflore lactique (BADIS et al., 2004 ;


15

BADIS et al., 2005). Aujourd’hui, il n’existe pas de normes et de valeurs limites reconnues

d'une manière générale au niveau international pour définir la qualité bactériologique du lait

de chèvre. Ainsi, pour le contrôle de la qualité de ce lait, seul le dénombrement des germes

totaux et dans quelques cas isolés celui des staphylocoques à coagulase positive

(Staphylococcus aureus) fréquents dans ce lait, sont effectués.

Toutefois, une bonne hygiène au niveau de l'exploitation et de la traite ainsi qu’un

refroidissement du lait directement pendant et après la traite, permettent d'éviter des teneurs

en germes trop élevées. (MAURER et al,. 2013). Concernant l’aptitude à la transformation

du lait caprin, la charge globale en germes, et la composition de la flore sont déterminants.

Des analyses concernant des germes ou des groupes de germes spécifiques se justifient.

Cependant seulement pour des germes problématiques, la composition de la flore du lait,

fournit aussi des informations précieuses au sujet de l'origine des germes et aussi concernant

de possibles sources de contamination (voir tableau I) (JAKOB et al., 2009).

Tableau I: Germes typiques de la flore du lait cru (JAKOB et al., 2009).

Germes GRAM positives Source de contamination

Germes sporulés aérobies Terre, poussière, foin (très répandu )

Germes sporulés anaérobies(Clostridies) Ensilage, fourrage vert ou non (Clostridies)

fermentation, bourbe

Entérocoques Fèces, résidus de lait

Staphylocoques Peau, muqueuses

Microcoques Peau, résidus de lait

Bactéries propioniques Peau, résidus de lait, fourrage vert en

fermentation, ensilage

Bactéries lactiques Plantes, ensilages, résidus de lait, Muqueuses

Bactéries corynéformes Peau, sol

Germes GRAM negatives

- Colibactéries (E. coli) Fècès, eaux usées

- Entérobactéries Plantes, fécès, eaux usées

Pseudomonas Eau, sol (très répandu)

Acaligenes, Flavobacterium, etc. Eau, sol (très répandu)

Levures Sol, plantes, résidus de lait (très

répandues)


16

1.3.5 Caractéristiques de Lactococcus lactis

Les bactéries appartenant au genre Lactococcus se présentent sous forme de coques

rassemblées en chaines de longueur variable. Elles appartiennent au groupe N de la

classification de Lancefield. Elles sont faiblement α-hémolytiques et non β-hémolytiques

(DELLAGLIO et al, 1994).

Le genre Lactococcus comporte plusieurs espèces et sous espèces, dont les plus

importants sont les espèces suivantes: Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus lactis ssp.

cremoris, Lactococcus lactis ssp .lactis biovar diacetylactis (TEUBER, 1995).Ces sous-

espèces et biovariants se différencient selon certains caractères biochimiques, telle la

production de diacétyle à partir du citrate, la désamination de l'arginine, la capacité à croitre

en présence de 4% de sel, à pH 9,2 et à 40° C. (BADIS et al, 2004).

Les deux sous espèces de Lc. lactis : Lc. lactis ssp. lactis et Lc. lactis ssp. cremoris se

distinguent essentiellement par leur capacité acidifiante et leur sensibilité à la température. La

sous espèce Lc. lactis ssp. cremoris est incapable de pousser au- dessus de 37°C. Le biovar

Lc. lactis ssp .lactis var diacetylactis, utilise le citrate, produit du diacétyle, de l’acétoine et du

CO2 (BADIS et al, 2005).

L’espèce Lactococcus lactis subsp lactis est une bactérie à GRAM positif, à catalase

négative aéro-anaérobie facultative. Elle se trouve en forme de coques disposées en chaines

de longueur variable. Les cellules sont ovoïdes ou sphériques de 0.5 à 1 μm de diamètre. Elle

possède un métabolisme homofermentaire et produit exclusivement de l’acide lactique L(+)

.

Le genre lactococcus, se caractérise par la présence d’antigène du groupe N, par son

caractère faiblement α hémolytique et non β-hémolytique, par sa température de croissance

minimale inférieure ou égale à 10° C et optimale voisine de 30°C, par sa thermosensibilité et

son inaptitude à croitre en présence de 6.5% de NaCl et à pH 9,6. Des travaux ont montré que

l’espèce Lactococcus lactis subsp lactis était résistance à l’acidité, à la bile, au sel et à la

congélation (KIM et al., 1999; TEUBER et GEIS, 2006). Elle présente aussi des propriétés

inhibitrices envers la flore d’altération et envers la flore pathogène du fromage, grâce à la

production de métabolites tels que les acides organiques, le péroxyde d’hydrogène et les

bactériocines ou à sa compétition écologique vis-à-vis des nutriments (O’SULLIVAN et al.,

2002 ; DORTU et al.,2009).


17

1.3.5.1 Habitat

Les bactéries du genre lactococcus sont les bactéries lactiques les plus importantes

d'un point de vue commercial. Cependant, on peut également les isoler des plantes

(SANDINE et al ,1972), ainsi que de la peau de certains animaux, et il semble que la

contamination qui a lieu au cours de la traite ait pour origine principale, le fourrage

(RAYNAUD, 2006). Les habitats les plus importants des Lactococcus lactis demeurent le

lait, les laits fermentés et les fromages, où on les trouve en quantité dominante

(DELLAGLIO et al, 1994).

1.3.6 Utilisation industrielle des ferments lactiques

Les ferments lactiques ont été produits pour la première fois sous forme concentrée et

congelée au cours des années 1965-1970, et commercialisés, sur le marché américain par les

compagnies Boll-Hansen et Marshall-Miles (MARUEJOULS et CAIGNIET, 1983),

permettant ainsi l’ensemencement semi-directe ou directe des cuves de fabrication. Ce type de

ferment a commencé à être produit, en France à partir de 1978 par les sociétés BOLL-

HANSEN et EUROZYME (MARUEJOULS et CAIGNIET, 1983).

L’utilisation industrielle des ferments lactiques se faisait autrefois grâce à la technique

du « pied de cuve », où une partie du produit fermenté était conservée pour ensemencer les

fermentations suivantes. La nécessité d’un contrôle plus précis du procédé de fabrication et de

la qualité finale du produit, ajoutée à une meilleure connaissance des propriétés

technologiques des souches, a permis de développer, à partir des années 1920, la méthode

d’ensemencement par précultures (LEJARD et al., 1994). A partir d’un échantillon liquide et

en respectant les étapes successives de propagation, le ferment est multiplié jusqu’au volume

nécessaire pour l’inoculation du produit. Cette méthode a permis une amélioration

significative dans la conduite du procédé et la standardisation du produit final, par

comparaison à la méthode du pied de cuve. Par contre, elle présente des inconvénients,

concernant le risque de contamination des cultures et de mutation des souches. De plus, son

coût est élevé, car elle nécessite un personnel spécialisé ainsi que des installations permettant

de faire le « scale up » des précultures (BEAL et al., 2008 ; SMITH, 2001 ; TAMIME et

ROBINSON, 1999). De plus, selon (TAMIME et ROBINSON, 1999), cette méthode n’est

pas appropriée dans le cas d’utilisation de cultures mixtes, car le maintien des proportions est


18

difficile à conserver. Actuellement, les producteurs de ferments font appel à leur

concentration.

1.3.7 Avantages de l’utilisation des ferments concentrés

Les avantages de l'utilisation des ferments concentrés se résument ainsi :

- simplicité de leur utilisation ;

- amélioration du contrôle de la fabrication ;

- obtention de produits plus réguliers, due à la standardisation des cinétiques

d’acidification, la régularité et la reproductibilité des productions ;

- limitation des risques de contamination et des infections phagiques ;

- flexibilité de l’organisation de la fabrication ;

- réduction et meilleure maîtrise des coûts de production ;

- possibilité de réalisation de mélanges précis entre les souches (MAYRA-MAKIEN et

BIGRET, 1998 ; BEAL et al., 2008).

1.4 Conservation et formes commerciales des ferments lactiques

La préparation en laiterie des levains de bactéries lactiques destinés à la fabrication

des produits laitiers fermentés tels que: fromages, beurre et laits fermentés, est une opération

délicate et coûteuse. Elle constitue pour les laiteries une charge importante en investissements

(matériel, cuves à levains) et en main-d'œuvre spécialisée, aussi bien au stade de l'entretien

des souches qu’au laboratoire de la laiterie. Lors de la préparation proprement dite du levain à

l'usine, des « accidents » peuvent se produire: contaminations diverses et attaques de

bactériophages. Ils ont pour résultat un mauvais développement des bactéries du levain et

éventuellement des fabrications défectueuses.

C’est pour cela qu’il existe plusieurs laboratoires étrangers étudiant actuellement ce

problème. On trouve aux Etats- Unis des suspensions concentrées et congelées de bactéries

lactiques utilisables pour la fabrication des produits laitiers (ACCOLAS et AUCLAIR,

1967).


19

1.4.1 Congélation

La congélation est actuellement la technique de conservation des bactéries lactiques la

plus utilisée dans le domaine agro-alimentaire. Une bonne maîtrise de cette opération est

nécessaire pour éviter ou minimiser les pertes de viabilité liées à l'abaissement de la

température et à la formation de glace au cours de la congélation. Cependant, elle induit aussi

des pertes de viabilité, inégalement maîtrisées jusqu'à présent. De plus, les ferments congelés

nécessitent une attention spéciale par rapport au maintien de la chaîne du froid lors de leur

transport et leur stockage. Il est aussi préconisé que les bactéries congelées soient stockées à

des températures inférieures à -45 °C, afin d’assurer la stabilité de la qualité et de l'activité des

ferments (STREIT, 2008). Cependant la congélation à une température de – 20°C permet une

conservation de la plus part des microorganismes pendant 1 à 2 ans et le métabolisme de ces

derniers en dessous de -18°C est totalement inhibé (LARPENT, 1997).

1.4.2 Réfrigération

La conservation à basse température réduit la croissance et l'activité des bactéries à

l'origine de la dégradation et prolonge la durée de conservation du lait. La conservation à des

températures en dessous du minimum de croissance entraîne une prolongation continue de la

phase de latence jusqu’à ce que la multiplication cesse et la croissance du microorganisme

s’arrête (DOYLE et al, 1997).

D’autre part, aux températures comprises entre 0 et 10°C des changements mineurs

dans les conditions physico-chimiques ont de grands effets sur la croissance bactérienne

(KORKEALA et al, 1989). Toutefois la réfrigération ne tue pas ou n’élimine pas une

contamination microbienne. Elle permet la croissance, le développement aux seuls

microorganismes psychrophiles capables de croître sur le lait à des températures en dessous

de 15 à 20°C (RUTHERFORD et al, 2007). La réfrigération du lait dès la ferme et son

stockage pendant un temps plus ou moins long sélectionne des bactéries psychrotrophes qui

peuvent devenir alors une flore dominante. Parmi ces bactéries le genre Pseudomonas est le

plus fréquent (MIRANDA et GRIPON, 1986).

1.5 Cryoprotection des bactéries lactiques

Il existe des substances protectrices qui permettent aux cellules de mieux supporter

une congélation ou une décongélation lentes et un stockage à température supérieure à - 50°C,


20

appelées cryoprotecteurs (FONSECA et CORRIEU, 2001). Ces substances, qui doivent être

peu volatiles, solubles dans l’eau et n’avoir aucun caractère toxique, ont des origines diverses

: polyols (glycérol, sorbitol), sucres (lactose, saccharose), protéines laitières (lait écrémé,

caséines), acides aminés (glutamate), antioxydants (acrobates) ou macromolécules

(maltodextrines) (BEAL et al., 2008).

Les bactéries contiennent naturellement des cryoprotecteurs : les sucres (sucrose et le

tréhalose), chez les bactéries G+ (BERT et al., 1998) ; les polyols (glycérol, sorbitol, et

mannitol), que l'on retrouve chez les algues, les champignons, les levures, les plantes et

certaines bactéries (KETS et al., 1996; HANS et al., 1995), les acides aminés et dérivés

(bétaïne et carnitine), chez plusieurs groupes de bactéries (CSONKA, 1989) et l'acide

tetrahydroxypyrimidine carboxylique (hydroxyectoïne) chez les bactéries halophiliques

(DELMORAL et al., 1994), le glutamate, la glutamine, la proline et l’alanine chez

Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas et d'autres micro-organismes

(JEWELL et al., 1991) et les acides aminés bêta chez les bactéries méthanogènes (LAI et

al., 1991).

Les cryoprotecteurs sont groupés en deux classes :

Cryoprotecteurs intracellulaires

Ce sont des substances de faible poids moléculaire (< 100) qui pénètrent à l'intérieur

de la cellule. Ils sont utilisés à une concentration de l’ordre de mol/l et agissent

principalement lors d’une congélation lente. Le plus important représentant de cette catégorie,

est le glycérol, mais on trouve aussi le diméthyle sulfoxide, méthanol éthanol, polyéthylène

oxyde, diméthylacétamide1-2 propanediol.

Cryoprotecteurs extracellulaires

Ce sont des substances de haut poids moléculaire (>10.000) qui se concentrent à

l'extérieur de la cellule. Ils sont utilisés à une concentration plus faible, de l'ordre de la milli-

mole/l, et sont indiqués lors des congélations rapides. Parmi les molécules les plus utilisées de

cette catégorie se trouvent le lactose, le saccharose, le tréhalose, la maltodextrine, polyvinyl

pyrolidone, le dextrane et l'amidon (STREIT, 2008).


21

1.5.1 Mécanisme d’action des cryoprotecteurs

Les mécanismes de la cryoprotection sont l'objet de nombreuses études de nos jours.

Les modes d'action les plus probables sont : un accroissement du volume de la phase liquide

interstitielle, à une température donnée, par dépression du point de congélation commençante

et donc réduction des effets liés à un refroidissement lent, une diminution de la taille des

cristaux de glace par abaissement de la température de nucléation et une réduction de leur

vitesse de croissance et une stabilisation de la configuration native des protéines (LESLIE et

al., 1995). Lorsque les premiers cristaux de glace apparaissent, les CPE se concentrent

uniquement à l'extérieur des cellules, contrairement aux autres solutés qui se concentrent à

l’intérieur et l’extérieur des cellules. La perte d'eau des cellules conduit donc à une

concentration en autre soluté, plus faible qu’en absence de CPE, minimisant ainsi les effets de

l'accroissement de concentration de la solution interstitielle. Au niveau des membranes

cellulaires séchées, des sucres comme le tréhalose et le saccharose peuvent remplacer les

molécules d'eau dans leur liaison avec les groupes polaires des phospholipides empêchant

ainsi les dommages durant la réhydratation (LESLIE et al., 1995). Le tréhalose et le

saccharose stabilisent la structure des protéines intracellulaires par ce phénomène de

remplacement de l'eau (CARPENTER et al., 1993). D'autres études ont montré que les

cryoprotecteurs étaient indispensables lors de la congélation quelles que soient les courbes de

refroidissement. Tous les cryoprotecteurs ne pénètrent pas dans les cellules. Il est d'usage de

les séparer en cryoprotecteurs non diffusants (la plupart des sucres ajoutés) et diffusants (le

glycérol, l'éthylène glycol, par exemple) (PEGG et DIAPER, 1988). Les cryoprotecteurs

diffusants vont se substituer à une partie de l'eau intracellulaire et permettre ainsi une

déshydratation partielle des cellules en plus de limiter la formation de cristaux de glace

intracellulaire. Ils réduisent également la vitesse de croissance de ces cristaux, abaissent la

température de solidification de l'eau intracellulaire, tel un « antigel », et modifient la forme

des cristaux de glace (HEY et MACFARLANE, 1998 ; PALASZ et MAPJETOFT, 1996).

Quand aux cryoprotecteurs pénétrants, ils protègent aussi au cours de la congélation et de la

décongélation en réduisant la taille des cristaux de glace et en induisant des formes de

cristaux moins traumatisantes. Ils permettent, via l'augmentation de la viscosité du milieu, la

diminution de la rapidité des mouvements de l'eau et de chocs osmotiques importants. De

plus, ils permettent, via l'augmentation de la pression osmotique, la réduction de la quantité de

cryoprotecteurs pénétrants, nécessaires à une bonne conservation (MERYMAN, 1974).

II Matériel et méthodes

Matériel et méthodes

22

2.1 Matériel d’étude

2.1.1 Lait de chèvre

Les prélèvements de lait proviennent de troupeaux de chèvres localisés à Bamindil

dans la région d'Ouargla. Ainsi trois prélèvements à partir de trois chèvres d'un troupeau et

deux prélèvements à partir de deux chèvres d'un autre troupeau de la même race ont fait l'objet de ce

travail. Un nettoyage correct de la mamelle est effectué avant la traite. Il est indispensable pour éviter

les contaminations de lait. Le lait est recueilli dans des flacons stériles de 250 ml, conservé et

transportés, dans une glacière au laboratoire.

2.1.2 Milieux utilisés

2.1.2.1 Milieu d'isolement, purification (M17)

La composition de ce milieu de culture est indiquée en annexe n°1.

2.1.2.2 Milieu de conservation

Le milieu de conservation est composé de 10g de peptone; 5g de NaCl; 3g d'extrait de

viande; 5g d'extrait de levure; 1g de glucose; 4g de Na2HPO4; 1l eau distillée. C'est un

bouillon et ne contient pas d'agar-agar (BALLA, 2011).

2.1.3 Appareillage

- Microscope optique (Motic, China);

- Réfrigérateur (Samsung, Kouria);

- Etuve (Memmert, Allemagne);

- Four pasteur (Memmert, Allemagne);

- Autoclave (Pbi-international, Milano);

- Bec benzène;

- Bain-marie (Memmert, Allemagne);

- pH mètre (Metrohom620, Allemagne);

- Densimètre (G-widder, Allemagne);

- Spectrophotomètre (WPA, China);

- Balance de précision (Denver, Allemagne);

- Plaque chauffante (VELP, Europe).

http://fr.wikipedia.org/wiki/Agar-agar


23

2.1.4 Petit matériel

Boites pétri en plastique, tube à essais, pipettes pasteur, erlenemeyer de 250 ml,

éprouvettes , fiole jaugée, bécher, pipettes graduées, burette, lames et lamelles, flacon en verre

de 250 ml, entonnoir.

2.1.5 Produits chimiques et réactifs

Eau physiologique, phénolphtaléine, solution de Soude (1N), bleu de méthylène 1%,

violet de gentiane, l'eau distillée, liquide de lugol, alcool, solution de Fuchsine de Ziehl, l'eau

distillée stérile, l'eau oxygénée 10 volume, peptone bactériologique, NaCl, HCl et NaOH,

Citrate d'ammoniac de Fe+3

(à la place ou Glycérophasphate de sodium), extrait de viande,

extrait de levure, Na PO-4, lactose, glucose.

Les cryoprotecteurs utilisés dans la présente étude sont les suivants :

- Le saccharose à 12% (DENI et PLOY, 2007).

- Le glycérol à 10% (DENI et PLOY, 2007).

2.2 Méthodes analytiques

2.2.1 Analyses physico-chimiques du lait

2.2.1.1 Mesure du pH

Le pH est déterminé à l'aide d’un pH-mètre étalonné. La valeur est lue directement sur

l'écran de l'appareil (AFNOR, 1986).

2.2.1.2 Acidité Dornic

Le dosage est effectué par neutralisation de 10 ml de lait avec de la soude N⁄ 9

en présence de phénolphtaléine (BALLA, 2011).

2.2.1.3 Densité

La densité est déterminée à l’aide d’un densimètre sur un lait maintenu au repos. Elle consiste

à plonger l'appareil dans une éprouvette de 250 ml remplie de lait, lorsqu'il se stabilise, la

lecture de la valeur de la densité se fait directement sur l'appareil (SOUID, 2011).


24

2.2.2 Analyses microbiologiques

2.2.2.1Test de la réductase

Le test de la réductase permet d'estimer la charge microbienne des échantillons de lait

collectés. Son principe est basé sur la décoloration du bleu de méthylène. La rapidité de cette

décoloration est directement proportionnelle au nombre de germes présents(LARPENT, 1997

; GUIRAUD, 1998). Ce test donne une idée de la quantité de germes présents dans le lait, de

leur activité et de leur vitesse de multiplication .La technique est indiquée en annexe n°2.


25

Figure 2: Procédure expérimentale

Le lait de Chèvre

(mélange)

Analyses physico-chimiques

(pH, densité, acidité Dornic)

Analyses microbiologiques

Test de la réductase

Isolement de la souche lactocoques

Ensemencement dans le milieu M17 (striés

d’épuisement)

Incubation à 30°C pendant 24h

Analyses préliminaires : Etude macro et microscopique, Test de la catalase

Pré-identification par des tests physicochimique et biochimiques

Purification, repiquages successifs

Propagation de la souche: mesure de la DO

Numérations des souches avant conservation Conservation des souches dans du bouillons de conservation

Congélation

sans

cryoprotecteurs

Congélation avec

cryoprotecteurs

(glycérol 10%,

saccharose 12%)

Réfrigération Conservation

à T ambiante

Détermination de la densité optique tous les jours J0 jusqu'à J0+20


26

2.2.2.2 Isolement de la souche

Nous avons préparé des séries de dilutions décimales de lait (10-1

à 10-5

) effectuées avec du

bouillon peptone- sel (1g l-1

peptone bactériologique, 8,5g l-1

NaCl), et le milieu de culture

d'isolement est ensemencé à partir de ces dilutions.

La technique est indiquée en annexe n°3.

2.2.2.3 Ensemencement dans un milieu sélectif

Les boites de pétri coulées par la gélose M17 gélosé, sont ensemencées en surface à

0.1 ml de la dilution effectuée, puis incubées à 30°C pendant 24h.

2.2.2.4 Pré-Identification de la souche

La pureté des souches sera contrôlée par des observations, macroscopiques et

microscopiques (après double coloration de GRAM), le test de la catalase, et des tests

physico-chimiques et biochimiques sont réalisés avant de procéder à la conservation.

2.2.2.4.1 Analyses préliminaires

2.2.2.4.1.1 Etude morphologique

2.2.2.4.1.1.1Observation macroscopique

L'examen macroscopique des cultures est le premier effectué après isolement de la

souche. Il porte sur la description de:

- La taille: approximative;

- La forme: caractérisée par l'allure des contours qui peuvent être lisses, dentelés,

déchiquetés. La surface (forme en relief) peut être bombée ou plate. Le centre est parfois

surélevé, parfois « ombiliqué »ou« creux »;

- L'aspect de la surface: qui peut être lisse, brillant (type S «smooth» : lisse), rugueux ou

mate (type R «rough»: rugueux);


27

- La coloration : la plupart des colonies n'ont pas de couleur définie. Elles sont jaunâtres,

grisâtres, ou blanchâtres mais certaines élaborent un pigment qui donne à la colonie une teinte

franche : jaune, rouge, violette; parfois le milieu lui même se colore, cas fréquent d'un

pigment bleu- vert. La pigmentation est un caractère d’identification important;

- La consistance: les colonies peuvent avoir un aspect muqueux comme elles peuvent être

filantes, grasses, crémeuses (qui se mettront facilement en suspension) sèches, pulvérulents

(qui se dissocieront mal dans l’eau) (MARCHAL et al., 1982);

- L'opacité : les colonies sont dites opaques si elles ne laissent pas passer la lumière,

translucides si elles laissent passer la lumière mais on ne voit pas les formes au travers,

transparentes, si elles laissent passer la lumière et on voit les formes au travers (MARCHAL

et al., 1982).

2.2.2.4.1.1.2 Observation microscopique

L'observation microscopique permet de faire une étude morphologique des cellules

d'une espèce bactérienne

2.2.2.4.1.1.2.1 Examen à l’état frais

Une méthode rapide consiste à observer entre lame et lamelle une suspension

bactérienne à l'objectif 40 sans fixation préalable par la chaleur ou l’alcool. Les

renseignements obtenus par cette observation concernant principalement la mobilité des

bactéries (DENI et PLOY, 2007).

2.2.2.4.1.1.2.2 Examen après double coloration de GRAM

La coloration de GRAM a été effectuée selon le protocole décrit par (PRESCOTT et

al.; 2003). La technique est indiquée en annexe n°4.

2.2.2.4.1.1.3 Test de la catalase

La catalase est une enzyme produite en abondance par les bactéries ayant un

métabolisme respiratoire qui détruit le peroxyde d'hydrogène et libère de l'oxygène VÉZINA


28

et LACROIX, 2000). La mise en évidence d'une catalase se fait par contact de la culture

microbienne avec une solution fraiche d'eau oxygénée (GUIRAUD, 2003).

2.2.2.4.2 Pré-Identifications physico-chimiques et biochimiques de la souche

Les souches isolées subissent des tests pré-identification physico-chimiques et

biochimiques.

2.2.2.4.2.1 Tests physico-chimiques des souches

2.2.2.4.2.1.1Croissance à différentes température

Du bouillon M17 est ensemencé est incubé à 10 °C pendant 1-7 jours, à 40°C pendant 24 h et

à 45°C pendant 24h (SIBOUKEUR, 2011).

2.2.2.4.2.1.2 Tolérance à la salinité

Du bouillon M17 à des concentrations de 2%, 4% et 6.5% de NaCl est ensemencés et incubé à

30°C pendant 24 h (SIBOUKEUR, 2011).

2.2.2.4.2.1.3 Tolérance au pH alcalin

Du bouillon M17 alcalinisé à pH 9.6 et 9.2 est ensemencés et incubé à 30°C pendant 24h

(SIBOUKEUR, 2011).

2.2.2.4.2.2 Tests biochimiques des souches

2.2.2.4.2.2.1Type fermentaire

Du bouillon M17 est ensemencé en présence d’une cloche de Durham, et incubé à 30°C

pendant 24h (SIBOUKEUR, 2011).

2.2.2.4.3 Purification par repiquage successif

La purification des bactéries est réalisée par 6 repiquages successifs dans la gélose

M17 par des stries d'épuisement.

2.2.2.5 Propagation de la souche


29

Avant d'être conservées, les bactéries doivent être obtenues en culture pure. Elles doivent,

durant la durée de stockage, être dans des conditions de non multiplication en milieu de

conservation en absence et présence des agents protecteurs et doivent être prélevées sur une

culture récente (DENI et PLOY, 2007).

Une colonie de bactérie préalablement purifiée est placée dans 1 ml de bouillon M17

puis incubée à 30°C pendant 24h. On introduit ensuite la culture précédente dans un tube

contenant 9 ml de milieu M17, puis on l'incube à nouveau à 30°C pendant 24h

(SIBOUKEUR, 2011). Préparer le milieu de conservation dans 5 erlenmeyers de 250 ml.

Deux erlenmeyers destinés à la congélation sont additionnés de l'agent cryo-protecteur

(glycérol 10%, saccharose 12%) et les trois autres erlenmeyers destinés à être stockés à la

température ambiante (témoin), réfrigération et congélation, sans addition de cryo-protecteur.

La culture est réalisée dans des erlenmeyers d’une capacité de 250 ml contenant du

milieu de conservation, avec la culture précédente (tube de 10 ml) à raison de 10%.

L'incubation est effectuée à 30°C pendant 24. La technique est indiquée en annexe n°5.

2.2.2.6 Mesure de la croissance de la souche isolée

2.2.2.6.1 Mesure de la turbidité

La croissance bactérienne est suivie par la mesure de la densité optique qui est effectuée

à une longueur d’onde de 600nm au spectrophotomètre (BEAL et al ,2008).

Dans le cas des dilutions, la turbidité est proportionnelle à la biomasse lorsqu'elle ne

dépasse pas la limite 0,5- 0,6 en unité d’absorbance (ONER et ERIKSON, 1986).

Lorsqu’une suspension cellulaire dans un milieu limpide est traversée par un faisceau

lumineux monochromatique, elle absorbe une quantité de lumière qui est proportionnelle à sa

concentration cellulaire selon la loi de Béer Lambert (BOURGEOIS et LEVEAU, 1991).

2.2.2.6.2 Courbe d'étalonnage

A partir de la culture à (10%), nous avons réalisé une gamme étalon (10-1

, 10-2

, 10-3

,

10-4

, 10-5

), à partir de laquelle nous avons tracé la courbe étalon, en mesurant l’absorbance à

600nm.


30

2.2.3 Conservation des souches isolées

Les solutions à 10% (Erlenmeyer) sont réparties dans des tubes en verre, stériles

munis d'un bouchon hermétique, de 5,4ml de capacité, puis elles sont conservées selon le

protocole indiqué en figure 3.

Le tableau II indique la constitution des lots expérimentaux de solutions.

Tableau II: Constitution des lots expérimentaux

Nature du

traitement de

conservation

Température

Ambiante

Réfrigération congélation

Lot Lot 1 Lot 2

Sans cryo-

protecteur Avec cryo-protecteur

Lot 3 glycérol saccharose

Lot 4 Lot 5

2.2.4 Suivi de la croissance par densité optique

La détermination de la souche est suivie chaque cinq jour de J0- J0+20 par la mesure de

la densité optique des échantillons, soumis à différentes conditions de stockage.

III Résultats et discussion

Résultats et discussion

31

3.1 Qualité physico-chimique du lait

Les résultats relatifs aux caractéristiques physico-chimiques du mélange des 5

échantillons du lait caprin, ayant fait l’objet de la présente étude. La moyenne de trois

répétitions est portée sur le tableau III.

Tableau III : Caractéristiques physico-chimiques de l'échantillon de lait caprin.

3.1.1 Mesure du pH

L'échantillon

analysé présente un

pH égal à 6,79. Ce dernier est proche celui du lait de vache compris entre 6,6 et 6,8 selon

VIGNOLA (2002) et VIERLING (2008). D’autres travaux rapportent des pH de lait de

chèvre légèrement plus acide que ceux du lait de vache. L'origine de ces valeurs de pH (5.2 ;

4.6) du lait caprin peut être attribuée à un début d'activité des bactéries lactiques endogènes

donc à l'âge du lait.

3.1.2 Acidité titrable

L'acidité titrable du lait dépend du nombre de moles d’acides présents dans ce produit.

Elle est inversement proportionnelle à son pH (MATHIEU, 1998). Le lait fraîchement trait

est selon BADAOUI (2000), légèrement acide. Cette acidité provient essentiellement des

caséines, des phosphates, du citrate et du CO2 dissous. Le lait acquiert ensuite une acidité,

dite acidité développée car elle est provoquée par l'acide lactique et autres acides issus

l'activité fermentaire des micro-organismes (BADAOUI, 2000). L'acidité titrable moyenne de

l'échantillon de lait caprin analysé est égale à 15.33°D. Cette valeur se rapproche de celle du

lait bovin (15.5 D°) (MOUALEK, 2011). Cette valeur est inférieure à 18°D celles rapportées

par BENGUETTAIA et LEMLEM (2013).

Paramètres physico-chimiques

Moyenne

pH

6.79

Acidité Dornic (°D)

15.33

Densité

1.0233


32

3.1.3 Densité

La densité du lait est en relation directe avec le taux de matière sèche (SIBOUKEUR,

2007). Le taux de matières sèches du lait caprin est plus faible que celui du lait bovin

(BENGUETTAIA et LEMLEM, 2013).

La densité du lait analysé est égale à 1.0233. Les auteurs (in SIBOUKEUR, 2011)

consultés rapportent que le lait caprin est moins dense par rapport au lait bovin 1.0322. Ceci

conforte le résultat enregistré dans cette étude.

3.2 Analyse microbiologique

3.2.1 Test de réductase

L'épreuve de la réductase n'est pas un moyen d'appréciation du nombre de bactéries

mais une épreuve destinée à estimer le degré de la contamination du lait

(PETRANSEXIENE, 1981).La décoloration de bleu de méthylène a commencé au delà de 5

heures. Cela signifie que l'échantillon de lait caprin testé présente une bonne qualité

hygiénique. Le taux de germes dans ce lait peut être estimé entre 105

à 2.105 germes/ml

(GUIRAUD ,1998).

3.2.2 Test de catalase

Cette enzyme est utilisée en bactériologie systématique pour l'identification des

bactéries. Ce caractère indique l’appartenance des bactéries lactiques au genre Lactococcus

bactéries à G+ aérotolérantes à ne pas posséder de système respiratoire (ni cytochrome, ni

catalase) (DESMAZEAUD et DE ROISSART, 1994).

Toutefois, certaines bactéries lactiques possèdent des pseudo-catalases non hémiques,

provoquant une effervescence (SIBOUKEUR, 2011)

3.3 Isolement, pré-identification et purification de la souche

3.3.1 Isolement de la souche de lactcoques

http://fr.wikipedia.org/w/index.php?title=Bact%C3%A9riologie_syst%C3%A9matique&action=edit&redlink=1


33

3.3.1.1 Observations macroscopiques

Nous avons pu isoler deux types de colonies qui différent par leur couleur et leur

taille. La première de couleur blanche, est de très petite taille (1mm), alors que la deuxième de

couleur jaune, est deux fois plus grande (2mm environ). (Photo 1)

Photo 1: Colonies isolées sur gélose M17.

.3.3.1.2 Observations microscopiques

La double coloration de GRAM indique des monocoques, des diplocoques et des

chainettes colorés en violet donc G +

pour les deux types de colonies isolées.

3.3.2 Pré-identification de la souche

3.3.2.1 Caractéristiques morphologiques, microscopiques, physico-chimiques et

biochimiques des deux souches isolées

Les caractères morphologiques, microscopiques, physico-chimiques et biochimiques

sont regroupés dans le tableau VI.

L'absence de dégagement de CO2 dans la cloche de Durham indique que la 1ère

souche est homofermentaire. Ce résultat est de nature à indiquer que cette souche appartient

au genre lactococcus (SEBASTIEN, 2008). La 2ème

souche est hétérofermentaire

(dégagement de CO2).


34

On observe un trouble dans le bouillon M17 après une incubation à 10°C, 40°C et

aucun trouble à 45°C pour les deux souches. Cela indique que les deux souches sont

mésophiles, un autre caracère des lactocoques.

Un trouble est observé dans des bouillons M17, à 2%, à 4% de NaCl pour les deux

souches. La 1ère

souche contrairement à la 2ème

, ne croit pas à 6.5% de NaCl. Cette inaptitude

constitue une des caractéristiques de l'espèce Lactococcus lactis.

La 1ère

souche se distingue de la 2ème

souche par sa croissance à pH=9.6. Ce caractère

permet de distinguer l’espèce Lactococcus lactis subsp lactis des espèces

Lactococcus lactis subsp cremoris et Lactococcus lactis subsp lactis diacetylactis

(GUIRAUD ,1998).

Le type fermentaire (homofermentaire), l'absence de croissance à 6.5% de NaCl et à

pH=9,6 semblent indiquer que la souche recherchée est la 1ere

souche (colonies blanches de

1mm de diamètre). Celle-ci fera l'objectif d'une purification pour la suite de ce travail.

Tableau VI : Caractéristiques morphologiques, physiologiques et biochimiques de la souche.

Tests d'identification

Colonie 1: blanche de

petite taille

Colonie 2: jaune de taille

plus grande

Observation

microscopique

Monocoque, diplocoques

et en chaînette

Monocoque, diplocoques

et en chaînette

Examen à l'état frais

(mobilité) Immobile Immobile

Examen après double

coloration de GRAM Gram+ Gram+

Test de catalase Effervescence Effervescence

Type fermentaire Homofermentaire Hétérofermentaire

Croissance à 10°C + +

Croissance à 40°C + +

Croissance à 45°C _ _


35

Croissance à 2% d'NaCl + +

Croissance à 4% d'NaCl + +

Croissance à 6,5% d'NaCl _ +

Croissance à pH 9,2 + +

Croissance à pH 9,6 - +

3.3.3 Purification

Après six repiquages successifs par des stries d'épuisement sur gélose M17, nous

avons obtenu des souches pures à partir de la colonie 1.

3.4 Propagation de la souche

3.4.1 Courbe d'étalonnage

La gamme nous a permis de tracer une courbe étalon en utilisant le spectrophotomètre

visible à 600nm (fig. 4).

Figure 4: Courbe d'étalonnage de la souche 1 isolée sur gélose M17

Cette courbe est utilisée pour le suivi de l’évolution de la biomasse durant la conservation de

la souche.

y = 5,349xR² = 0,8595

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12

D.O

à 6

00 n

m

Concentration de la biomasse


36

3.5 Conservation de la souche isolée

La courbe étalon permet de déterminer à J0, J0+5, J0+10, J0+15, J0+20 (soit tous les 5

jours), la concentration bactérienne de la culture initiale c'est-à-dire celle à 10%, selon le

tableau V:

Tableau V : Résultats [ ] de la biomasse bactérienne en % après 5 jours pendant 20jours.

Les jours J0 J0+5 J0+10 J0+15 J0+20

[ ] de la biomasse

bactérienne en % T

ambiante

9,8 7,1 6,7 4,6 6,3

[ ] de la biomasse

bactérienne en %

réfrigération

9,8 5,8 6,1 2,8 4,8

[ ] de la biomasse

bactérienne en %

congélation sans

cryoprotecteur

9,8 5 3,2 5,1 5,2

[ ] de la biomasse

bactérienne en %

congélation (glycérol)

9,8 5 6 0,07 1

[ ] de la biomasse

bactérienne en %

congélation

(saccharose)

9,8 49 43 42 8,4


37

3.5.1 Température ambiante

La figure 5: représente le lot n°1 des échantillons de cultures à 10% (20 tubes de

capacité 5.4 ml) stockés à la température ambiante (environ 29-31°C). L'évolution de la

biomasse pendant 20 jours.

Figure 5: Evolution de la biomasse conservée 20J à température ambiante

Nous remarquons une diminution de la biomasse qui passe de 10% à 4.6% à J0+15.

Ceci est du probablement au fait que le milieu ne convient pas à leur croissance. En effet le

milieu utilisé est un milieu de conservation et non un milieu de culture. La lyse cellulaire

sous l'action des enzymes protéolytiques endogènes serait à l’origine de cette baisse de

concentration cellulaire.

Cependant, selon MARIE-MADELEINE (2007), il peut persister une croissance par

libération de substances lors de la lyse pendant la croissance cryptique, ce qui semble

expliquer la croissance après J0+15.

4,6

y = -0,95x + 9,75

R² = 0,6383

0

2

4

6

8

10

12

J0 J0+5 J0+10 J0+15 J0+20

[ ]

de

bio

mass

e b

act

érie

nn

e en

(%)

durée de consevation en jour


38

3.5.2 Réfrigération

la figure 6: représente le lot n°2 des échantillons de cultures à 10% stockés à 8 °C.

L’évolution de la biomasse pendant 20 jours.

Figure 6: Evolution de la concentration bactérienne de la souche conservée à la réfrigération.

La figure 6 présente la même allure que la précédente .Toutefois, la diminution de la

biomasse est plus importante puisqu’elle passe de 10% à 2.8 % à J0+15.

3.5.3 Congélation sans cryo-protecteur

La figure 7: représente le lot n°3 des échantillons de cultures à 10% conservés dans

un congélateur de laboratoire réglé à -20°C.

2,8

y = -1,3x + 9,76

R² = 0,6482

0

2

4

6

8

10

12

J0 J0+5 J0+10 J0+15 J0+20

[ ]

de

bio

mass

e b

act

érie

nn

e

en (

%)

durée de conservation en jour

3,2

y = -0,91x + 8,39

R² = 0,3429

0

2

4

6

8

10

12

J0 J0+5 J0+10 J0+15 J0+20[ ]

de

bio

mass

e b

act

érie

nn

e en

(%)



39

Figure 7: Evolution de la concentration bactérienne de la souche conservée à la congélation

sans cryo-protecteur.

Nous remarquons une diminution de la biomasse qui passe de 10% à 3.2% à J0+10,

donc plus tôt comparativement aux lots 1 et 2.

La conservation de ce lot utilisant cette basse température semble nuire aux souches.

Le problème lié à la conservation par le froid est celui de la formation de cristaux de glace qui

peuvent être très dommageables sur les cellules. Il y a un stress osmotique. Le potentiel de

cette formation de glace intracellulaire augmente, si le potentiel osmotique à l'intérieur de la

cellule est différent de celui de milieu environnant. Les mécanismes de dommage de glace

intracellulaire restent floues, mais peut inclure la destruction physique des membranes, la

formation de bulles de gaz et de la perturbation des organites (FULLER, 2004).

Par ailleurs, les auteurs évoquent d’autres raisons de la sensibilité des cellules aux

traitements de conservation par le froid. Ainsi, les cellules de l'espèce Str. lactis récoltées en

phase exponentielle de croissance sont beaucoup plus sensibles à la congélation que les

cellules récoltées en début de phase stationnaire (ACCOLAS et AUCLAIR, 1999).

3.5.4 Congélation avec cryo-protecteur

3.5.4.1 Glycérol

La figure 8: représente le lot n°4 des échantillons de cultures à 10% stockés à -20 °C

en présence de glycérol à 10 %. Celui-ci est susceptible de protéger la membrane cellulaire.

0,07

y = -2,253x + 11,133

R² = 0,8137

-2

0

2

4

6

8

10

12

J0 J0+5 J0+10 J0+15 J0+20[ ]

de

bio

mass

e b

act

érie

nn

e

en (

%)



40

Figure 8: Evolution de la concentration bactérienne de la solution conservée à la congélation

(-20°C) avec cryo-protecteur Glycérol (10%).

Nous remarquons une diminution relativement importante de la biomasse en

comparaison avec les lots 1 et 2 puisqu’elle passe de 10% à 0.07 % à J0+15.

Par rapport au lot 3, nous constatons une diminution de la biomasse beaucoup plus

faible durant les 10 premiers jours, puisque la biomasse passe 10% à 6 % (versus 3.2 %) à

J0+10, d'où présence d’une protection relative.

Le Glycérol est un soluté poly-hydroxylé avec une forte solubilité dans l'eau, et une

faible toxicité lors l'exposition à court terme à des cellules vivantes (FULLER, 2004). En

général, on procède à un refroidissement lent et progressif, lors de l’utilisation de cryo-

protecteurs pénétrant les cellules tel que le glycérol.

Ce dernier, agit en évitant une trop forte déshydratation des cellules lors de la

formation primitive de glace extracellulaire puis en évitant la formation secondaire (qui suit la

déshydratation consécutive à la formation de glace extracellulaire) de trop nombreux et trop

gros cristaux de glace pure intracellulaire. Certains protocoles assurent au contraire un

refroidissement très rapide. II s'agit d'obtenir une "vitrification" intracellulaire non destructive

(FULLER, 2004).

3.5.4.2 Saccharose

La figure 9: représente le lot n°5 des échantillons de cultures à 10% stockés à -20 °C

en présence de saccharose à 12 %. Les résultats obtenus semblent être du plutôt à la densité

optique anormalement élevée des échantillons additionnés de saccharose. En effet les

échantillons du lot n°5 présentaient une consistance de gel (fig.9). Nous ne pouvons donc pas

tenir en ligne de compte ces résultats.


41

Figure 9: Evolution de la concentration bactérienne de la solution conservée à la congélation

avec cryo-protecteur Saccharose (12%).

y = -0,98x + 33,38

R² = 0,0062

0

10

20

30

40

50

60

J0 J0+5 J0+10 J0+15 J0+20

[ ]

de

bio

mass

e

bact

érie

nn

e en

(%

)


Conclusion

Conclusion

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Conclusion

Conclusion

L'objectif de ce travail vise à la conservation d'une souche pure de lactocoques isolée à partir

du lait caprin. Après culture sur gélose M17, pré-identifiée par une caractérisation

morphologique et des tests physico-chimiques et biochimiques, une purification par six

repiquages successifs a permis d’obtenir une souche pure destinée à des essais de

conservation. Deux techniques de conservation ont été utilisées : la réfrigération et la

congélation sans/avec cryo-protecteur (glycérol 10%, saccharose12%). Un milieu de

conservation a servi à l’élaboration des suspensions bactériennes à 10%.

Un lot d’échantillons de la suspension bactérienne a été conservé à température ambiante,

pour servir de témoin. L’estimation de la biomasse est réalisée par spectrophotométrie en

utilisant un courbe étalon (loi de Beer Lambert). L’évolution de la biomasse est suivie par la

mesure de la DO à longueur d'onde 600nm de suspensions bactériennes tous les 5 jours

durant 20 jours d’entreposage.

Les résultats obtenus indiquent une chute de la biomasse comme dans le cas des lots

entreposés à la température ambiante (témoin).

La biomasse initiale J0 à10%, diminue dans le cas de la réfrigération et de la congélation

sans cryo-protecteur jusqu'à la 2.8 % à J0+15 et à 3.2% à J0+10 respectivement. La congélation

avec cryo-protecteur (glycérol 10%) atteint 0.07 % à J0+15. Concernant la congélation avec

(saccharose à 12%), les résultats n'ont pas été retenus car la lecture a donné des valeurs

anormalement élevées, dues à la consistance du gel.

Cette étude mérite d’être reprise en utilisant d’autres méthodes de mesure de la biomasse tels

que la cellule Malassez ou le dénombrement. Des essais de conservation par lyophilisations

sont également intéressants à entreprendre ; La lyophilisation étant une méthode efficace

pour la conservation des bactéries.

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Z

ZELLER B. (2005). Le fromage de chèvre : spécificités technologiques et économiques.

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Annexes

Annexes

54

Annexe n°1

Le milieu M17 (OUADGHIRI, 2009).

-Tryptone........................................................2,50 g

- Peptone pepsique de viande .........................2,50 g

- Peptone papaïnique de soja ..........................5,00 g

- Extrait autolytique de levure.........................2,50 g

- Extrait de viande ...........................................5,00 g

- Lactose ..........................................................5,00 g

- Glycérophosphate de sodium ......................19,00 g

- Sulfate de magnésium ...................................0,25 g

- Acide ascorbique ...........................................0,50 g

- Agar bactériologique....................................15,00 g

Annexe n°2

Test de la réductase (LARPENT, 1997 ; GUIRAUD, 1998).

1) Homogénéiser l’échantillon par 25 agitations manuelles successives.

2) En placer 10 ml de l’échantillon, aseptiquement, dans un tube stérile fermé par un bouchon

stérile.

3) Ajouter alors 1ml d’une solution standardisé de bleu de méthylène à 5 mg pour 100 ml

d’eau.

4) Après fermeture de tube, on le retourne une ou deux fois pour obtenir un mélange

homogène du lait et du colorant.

5) Placer dans un bain d’eau à 37°C et noter le temps de cette immersion (le niveau de l’eau

du bain d’eau doit être supérieur à celui du lait dans le tube).

Décoloration en

Nombre de bactéries/ ml

Qualité du lait

5 heures ou plus

2 à 4 heures

Moins de 2 heures

100 000-200 000

200 000à 2 millions

2 à 10 millions

Bonne

Bonne à passable

Insuffisante

Annexes

55

Annexe n°3

Préparation des dilutions (SIBOUKEUR, 2011).

La dilution est réalisée afin de diminuer le nombre de colonies. Le meilleur résultat

(colonies isolées) est statistiquement obtenu pour des boites comportant entre 30 et 300

colonies (MADIGAN et al., 2007).

1ml de lait camelin ou bovin collecté est prélevée aseptiquement à l’aide d’une pipette

préalablement stérilisée. On aspire et on refoule le lait au moins une fois dans la pipette, avant

d’effectuer le prélèvement. La pipette ne doit pas être plongée de plus de 1 à 2 cm dans le lait.

La prise d’échantillon est introduite aseptiquement dans un tube contenant 9 ml de

diluant. La pipette ne doit pas entrer en contact avec le diluant.

Le tube est agité doucement mais suffisamment pour rendre la dilution homogène. Il

faut éviter le barattage survenant au cours d’une agitation trop violente.

A d’une nouvelle pipette stérile, aspirer et refouler le mélange à plusieurs reprises et prélever

1 ml de la première dilution (1/10), la pipette plongeant de 1 à 2 cm dans le liquide. Le

millilitre de dilution est introduit dans un deuxième tube contenant 9 ml de diluant, on obtient

ainsi la dilution au 1/100.

Une troisième opération est effectuée de la même manière afin d’obtenir une dilution au

1/1000. Une quatrième opération est réalisée afin d’obtenir une dilution de 1/10000.Une

nouvelle pipette stérile est employée pour chaque temps de ces dilutions.

Annexe n°4

Coloration de Gram

Déposer une goutte d‘eau physiologique stérile sur une lame bien propre ;

Prélever un échantillon de colonie et mélanger avec la goutte d’eau, strier et sécher par

passage rapide sur la flamme d’un bec benzène ;

Couvrir le frottis par du cristal violet pendant 60 secondes ;

Laver l’excès du colorant avec de l’eau distillée ;

Couvrir de lugol pendant 30 secondes ;

Laver à l’eau distillée pendant 5 secondes ;

Rincer immédiatement le frottis avec le mélange alcool - acétone en inclinant la lame

et par goutte à goutte jusqu’à disparition complète de la coloration violette;

Laver à l’eau distillée pendant 5 secondes ;

Annexes

56

Couvrir avec de la fuschine pendant 15 secondes

Laver à l’eau distillée pendant 10 secondes

Déposer une goutte d’huile à immersion sur le frottis et observer au microscope à un

fort grossissement.

Les cellules G+ absorbent la couleur du cristal violet et demeurent bleues violettes en

apparence, contrairement aux cellules Gram- qui apparaissent distinctement

Annexes

57

Annexe n°5

Etapes suivies pour conserver la souche isolée et purifiée

Etape n°1

= = = =

Etape n°2

= = = =

Etape n°3

= = = =

10% 10% 10% 10% 10%

1 colonie pure

Le tube contient 1ml de bouillon M17

Incuber les 05 tubes à température 30°C pendant 24heures

1ml d'inoculum

Le tube contient 9ml de bouillon M17


Verser le tube précédent Glycérol 10% Saccharose 12%

Erlenemeyer de 250ml

contient 90ml de milieu de

conservation pour prépare le

pourcentage 10%


Annexes

58

Etape n°4

Mesure de la turbidité à longueur d'onde 600nm et établissement d'un courbe étalonnage avec

10ml de la culture à 10%.

Etape n°5: conservation de la souche

= = = =

T ambiante Réfrigération congélation sans

Sans cryo-protecteur Avec cryo-protecteur

Glycérol

10% Saccharose

12%

Résumé

Contribution de l’étude de conservation d’une souche de lactocoques isolée àpartir du lait

caprin

La conservation de suspensions actives pendant des périodes assez longues permet leur utilisation en

technologie, sous forme liquide, congelée ou lyophilisée. Dans ce contexte, cette étude est une

contribution à la conservation, d'une souche de lactcoques (lactcoccus lactis) isolée à partir du lait caprin

par deux techniques : réfrigération et congélation en l’absence et/ou présence de cryo-protecteur (glycérol

10%, saccharose 12%) des échantillons conservés à la température ambiante servie de témoin. Les résultats

obtenus indiquent une chute de la biomasse quelque soit les conditions de conservation. En effet, la

biomasse initiale J0 à10%, diminue dans le cas de la réfrigération et de la congélation sans cryo-protecteur

jusqu'à la 2.8 % à J0+15 et à 3.2% à J0+10 respectivement. La congélation avec cryo-protecteur (glycérol

10%) atteint. Concernant la congélation avec saccharose à 12%), n’a pas pu.

Mots clé : Lait, caprin, lactocoques, conservation, cryo-protecteurs

Abstract

Contribution to the study of conservation of a strain of Lactococcus isolated from goat milk

Conservation of active suspensions for extended periods allows their use in technology, in liquid,

frozen or lyophilized form. In this context, this study is a contribution to the conservation of a

strain of lactcoques (lactcoccus lactis) isolated from goat milk by two techniques: cooling and

freezing in the absence and / or presence of cryo-protective (glycerol 10% sucrose 12%) of the

samples stored at room temperature served as control. The results indicate a decline in biomass

whatever the storage conditions. Indeed, the initial biomass D0 to 10%, decreases in the case of the

refrigerating and freezing cryo-protector without 2.8 to 15% and at day 0 at 3.2% to 10 J0

respectively. Freezing with cryo-protective (10% glycerol) achieved. On freezing with sucrose

12%), the Beer-Lambert law is not verified.

Keywords: Milk, goat, Lactococcus, conservation, cryo-protective.

الملخص

المعزولة من حليب الماعز lactocoques في دراسة حفظ الساللة مذخل

, عهً شكم سائم , من أجم انسماح باسخعمانها فٍ انصناعت انغزائُت , دفظ مذهىل بكخُشٌ نشط خالل فخشاث صمنُت طىَهت انمذي

راث اننىع lactcoquesحهذف هزه انذساست إنً انمساهمت فٍ دفظ انسالنت , فٍ هزا اإلطاس . مثهج او مجفف بانخجمُذ

(lactcoccus lactis) , انخخضَن فٍ انبشاد وانخخضَن فٍ انمجمذ بىجىد أو عذو وجىد :بخقنُخُن, انمعضول من دهُب انماعض

اننخائج انمخذصم . وانعُناث مذفىظت فٍ دسجت دشاسة عادَت كشاهذ, ( 12%انسكشوص بنسبت , 10%انجهُسشول بنسبت )انذافظ

نكم من حقنُت حخضَن فٍ انبشاد و حقنُت %3.2 و2.8 إنً غاَت %10عهُها حىضخ نضول نهكخهت انبكخُشَت انمخضنت باننسبت االبخذائُت

( 10%انجهُسشول بنسبت ) أما بما َخعهق بخقنُت حخضَن بىجىد دافظ , عهً انخشحُب J0+10 و J0+15 حخضَن فٍ انمجمذ فٍ انُىو

أما فٍ ما َخص حقنُت حخضَن بىجىد دافظ من نىع J0+15 ; فٍ انُىو % 0.07 انً غاَت 10 %اننخائج كانج كماَهٍ من

. اننخائج انمخذصم عهُها كانج عباسة عن قُاط ننسبت حشكُض انسكشوص فٍ انعُنت انمخضنت 12 %سكشوص

. انذافظ, حقنُت حخضَن , ,lactocoques, انماعض, دهُب:الكلمات المفتاحية

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Mémoire MASTER ACADEMIQUE Thème Contribution à l'étude de