2
1162 Specialia EXPERIENTIA 32]9 g~nes. La nature de l'organe utilis6 semble indiff6rente, puisque nous obtenons des cas positifs darts les 5 s6ries d'exp6riences et que les pourcentages de r6ussite sont toujours tr~s voisins. Ce pourcentage est 16g~rement su- p6rieur lors des injections de broyats d'ovaires de femelles th61yggnes. Les r6sultats des t6moins ont toujom-s 6t6 n~gatifs: les implantations d'organes provenant de m~les normaux sont incapables d'induire le d6velopperoent des oost6gites chez les males normaux; il en~st de hi,me pour les injections de broyats d'ovaires de femelles nor- males. Ces exp6riences d6montrent que le facteur responsable de la diff6renciation d'oost6gites chez les males inter- sexu6s peut 6tre transmis exp6rimentalement ~ des males normaux; ceux-ci acquigreot l'une des caract6ristiques morphologiques des intersexu6s. En g6n6ral, la forme des gnathopodes n'est pas modifi~e; dans 3 cas seulement ces gnathopodes ont 6volu6 vers la forme des gnathopodes de males intersexu6s. Une exp6rience eompl6mentaire montre que les organes des males transform6s en intersexu6s peuvent ~ leur tour induire l'apparition d'oost6gites chez des males normaux. Des oost6gites se sont diff6renci6s qnel que soit l'organe implant6 : 6 cas positifs sur 11 avec les implants de gtande androg~ne, 8/12 avec des implants testiculaires, 1/10 avec des implants de muscles, 1/8 avec des implants de v6si- cules s6minales, soit un total de 16/41. Le pourcentage moyen de r6ussite (39%) est tr~s voisin de celui obtenu dans la premiere exp6rience (40%). Nous pouvons con- clure de cette exp6rience que le facteur responsable de l'intersexualit6 est capable de se multiplier dans des males normaux. B) Implantations h6t6rosp6cifiques. Afin de d6terminer si le facteur responsabte de l'intersexualit6 est sp6cifique, des exp6riences analogues out 6t6 r~alis6es en utilisant comme receveurs les males de deux espgces off l'inter- sexualit6 des caract~res sexuels externes n'est pas connue : Orchestia cavimana et Talitrus saltator. Chez Talitrus saltator, nous avons observ6 11 cas po- sitifs sur 13 et 19 sur 26 chez Orchestia cavimana. La pro- portion de cas positifs est, dans les deux espSces, sup6- rieure A celle obtenue chez Orchestia gammarellus. Des in- dices d'une plus forte intersexualit6 se sont manifest6es chez O. cavimana: les gnathopodes de quatre intersexu6s exp6rimentaux se sont d6diff~renci6s et ont 6volu6 vers une forme interm6diaire entre la forme male et la forme femelle; d'autre part les oost6gites de ces intersexu6s ont d6velopp6 des soles juv6niles, ce qui n'a jamais ~t~ ob- serv6 chez les intersexu6s d'Orchestia gammarellus. Discussion. Ces exp6riences renforcent l'hypoth~se de l'existence d'un facteur 6pig~n6tique responsable de l'in- tersexualit6 des males. Elles d6montrent que ce facteur poss~de un pouvoir infectieux et qu'il n'est pas localis6 dans les gonades. Les implantations h6t6rosp6cifiques indiquent une absence de sp~cificit6 du facteur, au moins entre esp~ces voisines. L'aspect paradoxal du d6veloppement d'oost6gites chez des males normaux doit 8tre soulign6. Chez Orchestia gammarellus, la diff6renciation des oost6gites n'est pas un caract~re sexuel neutre inhib6 par la glande androg~ne. De nombreuses exp6riences 6 ont d6montr6 que la pr6- sence des ovaires est indispensable A la diff6renciation des oost6gites: ceux-ci ne se diff6rencient jamais spontan6- ment chez des males priv6s de glandes androggnes, mais apparaissent aprSs l'implantation d'un fragment d'ovaire. Nous retrouvons, lors de nos exp6riences, un r6sultat d6j 5. observ6 par CHARNIAUX-COTTON 7: les glandes andro- g~nes des males intersexu6s peuvent induire l'inter- sexualit6 chez des males normaux. Cette action peut diffieilement 6tre imput6e A des anomalies de l'hormone androgSne comme le concluait CHARNIAUX-COTTON 8, puisque d'autres organes de males intersexu6s ou de femelles th61yg~nes ont la m~me action. On pourrait supposer que le facteur intersexualisant agit an niveau de la glande androggne et de l'appareil g6nital in situ. Toutefois, des observations pr61iminaires indiquent que la pr6sence des glandes androg~nes et des testicules autochtones n'est pas n6cessaire ~ la diff6ren- ciation des oost6gites. Celle-ci a 6t6 observ6e aprSs l'in- jection de 5 ml de broyat de muscles de males intersexu6s dans des males priv6s de leurs glandes androg6nes ou de leurs testicules. A titre d'hypoth8se, on peut penser que le facteur responsable de l'intersexualit6 agit directement au niveau des cellules 6pith61iales intervenant dans la formation des oost6gites. 6 H. CHARNIAUX-COTTON, in Organogenesis (Eds. H. DE HK&N and H. UNSPRUNG; Holt, Rinehart and Winstin, New York 1965), p. 701. 7 H. CHARNIAUX-COTTON, C. r. Aead. Sci., Paris 245, 1665 (1957). s H. CRARNIAUx-CoTTo~r Bull. Soe. Zool. 87, 338 (1962). Metabolic Requirements for Entry of DNA in Branhamella catarrhalis G. 13RYANT and R. t3. OTERO1 Department o/ Biological Sciences, Eastern Kentucky University, Richmond (Kentucky dOd75, USA), 5 April 1976. Summary. Although requirements for transformation in Branhamella catarrhalis are quite complex, DNA synthesis does not appear to be one of these needs, as indicated by tile inability of nalidixic acid to interefere with transformation. Exogeneous sources of energy, such as cAMP and cGMP, also failed to enhance frequency, suggesting cells may actively engage in energy production to achieve uptake of DNA, or lack a transport mechanism for these compounds. Previous reports 2,a have shown that Branhamella ca- tarrhalis (formerly known as Neisseria catarrhalis 4) trans- formation can be inhibited with antibodies, various chemical inhibitors, and antibiotics. These studies have further demonstrated that B. catarrhalis transformation is dependent on: 1. protein synthesis as evidenced by chloramphenicol inhibition ; 2. sites present on cell surface as sodium periodate and specific antibodies interferred with transformational frequency; 3. cell wall formation as indicated by cycloserine interference; and 4. energy as shown by dinitrophenol intervention. This study was concerned with the effects of nalidixic acid, an inhibitor of DNA synthesis 5, to determine if this activity is required for DNA entry in this system. Also, the effects of adding an exogeneous supply of energy molecules, such as cyclic adenosine monophosphate and

Metabolic requirements for entry of DNA inBranhamella catarrhalis

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1162 Specialia EXPERIENTIA 32]9

g~nes. La n a t u r e de l ' o rgane uti l is6 semble indif f6rente , pu i sque nous o b t e n o n s des cas posi t i fs darts les 5 s6ries d ' exp6r iences e t que les pou r cen t ages de r6ussi te son t t ou jou r s tr~s voisins. Ce p o u r c e n t a g e est 16g~rement su- p6r ieur lors des in jec t ions de b r o y a t s d ' ova i r e s de femelles th61yggnes. Les r6su l t a t s des t 6moins on t toujom-s 6t6 n~gat i fs : les i m p l a n t a t i o n s d ' o rganes p r o v e n a n t de m~les n o r m a u x son t incapab les d ' i n d u i r e le d6ve lopperoen t des oost6gi tes chez les males n o r m a u x ; il e n ~ s t de h i , m e pou r les in jec t ions de b r o y a t s d ' ova i r e s de femelles nor- males.

Ces exp6riences d 6 m o n t r e n t que le fac teur responsab le de la d i f f6rencia t ion d 'oos t6gi tes chez les males in te r - sexu6s p e u t 6tre t r a n s m i s e x p 6 r i m e n t a l e m e n t ~ des males n o r m a u x ; ceux-ci acqu ig reo t l ' une des ca rac t6r i s t iques morpho log iques des in tersexu6s . E n g6n6ral, la forme des g n a t h o p o d e s n ' e s t pas modifi~e; d a n s 3 cas s eu l emen t ces g n a t h o p o d e s on t 6volu6 vers la forme des g n a t h o p o d e s de males in tersexu6s .

Une exp6r ience e o m p l 6 m e n t a i r e m o n t r e que les organes des males t r ans fo rm6s en in te rsexu6s p e u v e n t ~ leur t o u r indu i re l ' a p p a r i t i o n d 'oos t6gi tes chez des males n o r m a u x . Des oost6gi tes se son t diff6renci6s qnel que soit l ' o rgane i m p l a n t 6 : 6 cas posi t i fs sur 11 avec les i m p l a n t s de g tande androg~ne, 8/12 avec des i m p l a n t s tes t iculai res , 1/10 avec des i m p l a n t s de muscles, 1/8 avec des i m p l a n t s de v6si- cules s6minales, soi t u n t o t a l de 16/41. Le pou r cen t age m o y e n de r6ussi te (39%) est tr~s vois in de celui o b t e n u dans la p remie re exp6r ience (40%). Nous pouvons con- clure de ce t te exp6r ience que le f ac teu r responsab le de l ' i n t e r sexua l i t6 es t capab le de se mul t ip l i e r dans des males n o r m a u x .

B) I m p l a n t a t i o n s h6t6rosp6cif iques. Af in de d 6 t e r m i n e r si le f ac teu r responsab te de l ' i n t e r sexua l i t6 es t sp6cifique, des exp6riences ana logues ou t 6t6 r~alis6es en u t i l i s an t c o m m e receveurs les males de d e u x espgces off l ' in te r - sexual i t6 des carac t~res sexuels ex t e rnes n ' e s t pas connue : Orchestia cavimana et Talitrus saltator.

Chez Talitrus saltator, nous avons observ6 11 cas po- sit ifs sur 13 et 19 sur 26 chez Orchestia cavimana. La pro- po r t i on de cas posi t i fs est, dans les deux espSces, sup6- r ieure A celle o b t e n u e chez Orchestia gammarellus. Des in- dices d ' u n e plus for te in te r sexua l i t6 se son t mani fes t6es chez O. cavimana: les g n a t h o p o d e s de q u a t r e in te rsexu6s e x p 6 r i m e n t a u x se son t d6diff~renci6s et on t 6volu6 vers une forme in te rm6dia i re en t re la fo rme male et la forme

femelle; d ' a u t r e p a r t les oost6gi tes de ces in te r sexu6s o n t d6velopp6 des soles juv6ni les , ce qu i n ' a j ama i s ~t~ ob- serv6 chez les in te rsexu6s d'Orchestia gammarellus.

Discussion. Ces exp6r iences r en fo rcen t l ' hypo th~se de l ' ex i s tence d ' u n f ac t eu r 6pig~n6tique responsab le de l ' in- t e r sexua l i t6 des males. Elles d 6 m o n t r e n t que ce f ac t eu r poss~de u n pouvo i r in fec t i eux et qu ' i l n ' e s t pas localis6 dans les gonades . Les i m p l a n t a t i o n s h6t6rosp6cif iques i n d i q u e n t une absence de sp~cificit6 du facteur , au moins en t re esp~ces voisines.

L ' a s p e c t p a r a d o x a l du d 6 v e l o p p e m e n t d 'oos t6gi tes chez des males n o r m a u x doi t 8tre soulign6. Chez Orchestia gammarellus, la d i f f6rencia t ion des oost6gites n ' e s t pas u n carac t~re sexuel n e u t r e inhib6 pa r la g lande androg~ne. De n o m b r e u s e s exp6riences 6 on t d6mon t r6 que la pr6- sence des ovai res es t ind i spensab le A la d i f f6rencia t ion des oost6gi tes : ceux-ci ne se d i f f6rencient j a m a i s s p o n t a n 6 - m e n t chez des males priv6s de g landes androggnes , ma i s a p p a r a i s s e n t aprSs l ' i m p l a n t a t i o n d ' u n f r a g m e n t d 'ova i re . Nous r e t rouvons , lors de nos exp6riences, u n r6 su l t a t d6j 5. observ6 pa r CHARNIAUX-COTTON 7: les g landes and ro - g~nes des males in te r sexu6s p e u v e n t indu i re l ' i n te r - sexual i t6 chez des males n o r m a u x . Cet te ac t ion p e u t d i f f ie i lement 6tre impu t6e A des anomal ies de l ' h o r m o n e androgSne comme le conc lua i t CHARNIAUX-COTTON 8, pu i sque d ' a u t r e s o rganes de males in te rsexu6s ou de femelles th61yg~nes on t la m~me act ion.

On p o u r r a i t suppose r que le f ac teu r i n t e r s e x u a l i s a n t agi t an n i v e a u de la g lande androggne et de l ' appa re i l g6ni ta l in situ. Toutefois , des obse rva t i ons pr61iminaires i n d i q u e n t que la pr6sence des g landes androg~nes et des tes t icules a u t o c h t o n e s n ' e s t pas n6cessaire ~ la diff6ren- c ia t ion des oost6gites. Celle-ci a 6t6 observ6e aprSs l ' in - j ec t ion de 5 ml de b r o y a t de muscles de males in te r sexu6s dans des males pr iv6s de leurs g landes androg6nes ou de leurs test icules .

A t i t r e d ' hypo th8se , on p e u t pense r que le f ac teu r responsab le de l ' i n t e r sexua l i t6 agi t d i r e c t e m e n t au n iveau des cellules 6pith61iales i n t e r v e n a n t dans la f o r m a t i o n des oost6gites .

6 H. CHARNIAUX-COTTON, in Organogenesis (Eds. H. DE HK&N and H. UNSPRUNG; Holt, Rinehart and Winstin, New York 1965), p. 701.

7 H. CHARNIAUX-COTTON, C. r. Aead. Sci., Paris 245, 1665 (1957). s H. CRARNIAUx-CoTTo~r Bull. Soe. Zool. 87, 338 (1962).

M e t a b o l i c R e q u i r e m e n t s for E n t r y of D N A in Branhamella catarrhalis

G. 13RYANT and R. t3. OTERO1

Department o/ Biological Sciences, Eastern Kentucky University, Richmond (Kentucky dOd75, USA), 5 April 1976.

Summary. A l t h o u g h r e q u i r e m e n t s for t r a n s f o r m a t i o n in Branhamella catarrhalis are qu i te complex, D N A syn thes i s does n o t a p p e a r to be one of these needs, as i nd ica t ed b y tile i nab i l i t y of nal id ix ic acid to in te refere w i t h t r a n s f o r m a t i o n . Exogeneous sources of energy, such as c A M P a n d cGMP, also fai led to enhance f requency , sugges t ing cells m a y ac t ive ly engage in ene rgy p r o d u c t i o n to ach ieve u p t a k e of DNA, or lack a t r a n s p o r t m e c h a n i s m for these compounds .

P rev ious r epor t s 2,a h a v e s h o w n t h a t Branhamella ca- tarrhalis ( former ly k n o w n as Neisseria catarrhalis 4) t r a n s - f o r m a t i o n can be i n h i b i t e d w i t h an t ibodies , va r ious chemica l inh ib i to rs , a n d an t ib io t ics . These s tud ies h a v e f u r t h e r d e m o n s t r a t e d t h a t B. catarrhalis t r a n s f o r m a t i o n is d e p e n d e n t on: 1. p ro t e in syn thes i s as ev idenced b y ch lo r amphen i co l i nh ib i t i on ; 2. s i tes p r e s en t on cell surface as sod ium pe r ioda te and specific an t ibod ies in te r fe r red

w i th t r a n s f o r m a t i o n a l f r equency ; 3. cell wall f o r m a t i o n as i nd ica t ed b y cycloserine in te r fe rence ; a n d 4. ene rgy as shown b y d i n i t r o p h e n o l i n t e rven t ion .

This s t u d y was concerned w i t h the effects of na l id ix ic acid, a n i nh ib i t o r of D N A syn thes i s 5, to d e t e r m i n e if t h i s a c t i v i t y is r equ i red for D N A e n t r y in th i s sys tem. Also, t he effects of a d d i n g an exogeneous supp ly of ene rgy molecules, such as cyclic adenos ine m o n o p h o s p h a t e a n d

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15. 9. 1976 Specialia 1163

cyclic guanosine monophospha t e , to the t r ans fo rma t ion sys tem were examined to de te rmine the i r abi l i ty to en- hance t r ans fo rmat ion .

Materials and methods. The procedure for the p repara - t ion and isolat ion of a s t r ep tomyc in - r e s i s t an t m u t a n t (STR) was similar to t h a t of o ther inves t iga tors 6, 7. The actual procedure for the S T R t r ans fo rma t ion expe r imen t has been descr ibed elsewhere ~, a. The minimal inh ib i to ry concen t ra t ion of nalidixic acid was de te rmined according to the m e thods of GROOVE and RANDALL s. Compe ten t cells were exposed to va ry ing concen t ra t ions of th is com- pound (100, 500 and 1000 #g) for 30 min dur ing the la t t e r s egmen t of t he log phase. F r o m this point , the t r ans for - ma t ion was comple ted as descr ibed elsewhere a. Cyclic adenosine m o n o p h o s p h a t e (cAMP) and cyclic guanosine m o n o p h o s p h a t e (cGMP), a t concen t ra t ions of 10 /~g and 100 #g per ml, were added to the t r ans fo rma t iona l sys t em in the same m a n n e r as the nalidixic acid.

Results and discussion. The results of 3 i n d e p e n d e n t s tudies showed a ve ry sl ight reduc t ion in the t r ans fo rma- t ionaI f requency as compared wi th the controls when nalidixic acid a t the 500 #g level was added to the log phase culture. No loss of v iabi l i ty a t th is concen t ra t ion was observed. Grea ter concen t ra t ions d e m o n s t r a t e d de- t r imen ta l effects. These resul ts indicate t h a t D N A inhi- bi t ion caused by nalidixic acid does not interfere wi th the t r ans fo rma t ion of B. catarrhalis, thus suggest ing t h a t nuclear repl icat ion m a y no t be a prerequis i te for th is model. These results are similar to observa t ions in o ther systems, such as Neisseria meningitidis 9, Bacillus sub- tilts 1~ and Streptococcus pneumoniae n. ARCHER and LANDMAN 12 have shown t h a t donor D N A can en te r a c o m p e t e n t celI regardless of the location of repl icat ive poin ts of the recipient D N A on the membrane . This would indicate t h a t D N A can en te r a t any poin t on the m e m b r a n e where receptors are located, and no t jus t a t points where DNA synthes is is occurring.

The exposure of c o m p e t e n t cells to cAMP and cGMP prior to t he addi t ion of D N A did no t al ter in any way the t r ans fo rma t iona l f requency in th is model sys tem. In- h ibi tors of energy me tabo l i sm have been shown to block DNA up take in the pneumococc i la, 14; in Hemophilus in- /luenzae15; in B. subtilis1% in N. meningitidis 9 and in B. catarrhalis3. I t seems reasonable t h a t if energy is re- quired for DNA uptake , supply ing a popula t ion of com-

p e t e n t cells wi th a source of p re formed energy molecules would be s t imula to ry to t r ans fo rmat ion . Al though the role of these two chemicals in the cell is no t comple te ly unders tood , it appears t h a t cAMP in par t icu lar m a y serve as an ac t iva to r of synthes is of m a n y catabol ic en- z y m e s l L WISE, POWERS and ALEXANDER 18 have found t h a t cAMP added to exponent ia l cul tures of H. in/luenzae raises the t r ans fo rmab i l i t y of cells as m u c h as 10,000 fold af ter one genera t ion t ime in g rowth medium. E i the r these energy precursors have no s t imula to ry effect on this model, or the cells do no t possess a t r a n s p o r t sys tem for them. Ano the r a l t e rna t ive is t h a t the cells mus t ac t ively engage in energy me tabo l i sm to achieve uptake . This is suppor t ed by the work of LACKS and GREENBERG 19 who have shown t h a t an exogeneous source of A T P canno t subs t i tu t e for sugar in the med ium for D N A up take in St. pneumoniae.

1 To whom reprint requests should be sent. Eastern Kentucky University Grant No. 05-03-422-41 was the sole support of this project and was given to the last author. R. B. OTERO and J. W. SNYDER, Experientia 29, 888 (1973).

3 j. L. KENNEDY, J. W. SNYDER and R. B. OTERO, Experientia 30, 1147 (1974). R. E. BUCHANAN and N. E. GIBBONS, Bergy's Manual o] Deter- minative Bacteriology (Williams and Wilkins, Baltimore 1974).

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Insulin Res i s tance and Related Electrical Act iv i ty of the Smal l Intest ine

M. RUCKEBUSCH and T. E. C. WEEKES 1

Laboratoire de Physiologie, Ecole Nationale Vdtdrinaire, 23, chemin des Capelles, F-31076 Toulouse Cddex (France), 2d December 1975.

Summary. Pos tp rand ia l d i s rup t ion of the migra t ing myoelect r ic complex is of longer dura t ion in obese hyper insu lemic Zucker ra t s t h a n in control rats. No pos tp rand ia l d i s rupt ion was seen in an insulin res i s t an t dog. This gives fu r the r suppor t to a ma jor role for insulin in control of gut ac t iv i ty .

A cyclic recurr ing sequence of regular spiking ac t iv i ty (RSA) in which spike burs t s are super imposed on all slow waves is charac ter i s t ic of the small in tes t ine in m a n y species, e.g. ra t s or dogs fas ted for 24 h ~. E a c h phase of R S A is p receded by a per iod of irregular spiking ac- t i v i t y (ISA) and followed by a quiescent phase. This cyclic p a t t e r n has been called the migra t ing myoelec t r ic complex (MMC), because of its slow p ropaga t ion along the smal l in tes t ine . The MMC recurs a t in tervals of abou t

15 min in rats and 80-110 min in dogs 3. The MMCs dis- appear af ter feeding being replaced by a pos tp rand ia l

1 On leave from the Rowett Research Institute, Bucksburn, Aberdeen (Scotland).

2 M. RUCKEBUSCH and J. P. FERRE, C. r. Soc. Biol., Paris 167, 2005 (1973).

a M. R~JCKEBUSCH and J. FIORAMONTI, Gastroenterology 68, 1500 (1975).