mi cie e - Genopole - Réussir ensemble en Biotechnologie · •of the microscope : NAand the ratio

La microscopie optique

Nicolas Sandeau Maître de Conférences

A quoi ça sert?

Observer un objet, un phénomène…avec une bonne résolution spatiale (voire temporelle) sans trop de perturbations (innocuité).L’instrument doit être sensibleet la mesure (l’image) contrastée.

Le plan• Les contrastes• Les microscopies de fluorescence• La microscopie confocale• Augmenter la résolution• Les microscopies non linéaires

Les 1er microscopes

Vers 1880, des détails aussipetits que 0.2 µm sont déjàaccessibles.

Microscope Carl Zeiss 1891

Principe du microscope

Source enEpi-illumination

Vers l’oeil

Vers caméra

Imageur

Source en transmission

Détection en forward

Principe du microscope

Image intermédiaire

Oculaire

160 mm

Plan image

Oculaire

Spécimen

Objectif

160 mm

Spécimen

Lentille de Telan

Objectif

Les contrastes en

microscopiemicroscopie

Contraste en microscopie

D’où vient le contraste?

⇒Absorption, diffusion,réfraction, réflexion.

Variations d’intensité, de couleurs, de netteté


Cam

éra

Lampe (incohérent)

Condenseur

Filtre occultant ⇒ Fond noirFiltre déphasant ⇒ Contraste de phase


Cam

éra

Lampe (incohérent)

Condenseur



Cam

éra

Lampe (incohérent)

Condenseur


ei'

Microscopie sur fond noir

Objectif

Rayons diffractés

Rayons non-diffractés

Spécimen

Condenseur

Filtre annulaire

Lumièreblanche

http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/darkfieldgallery

http://prn1.univ-lemans.fr/prn1/siteheberge/PublisCours-OPI/OPI_fr_M03_C04/co/Contenu_K22.html

Contraste de phase

Plan Image

Source

Lame de PhaseDiaphragme annulaire

(Zernike prix Nobel 1953)

Source

Plan focal arrière de l’objectif

Ouverture du condenseur

Contraste de phase(Zernike prix Nobel 1953)

Image de la phase

http://www.microscopyu.com/articles/phasecontrast/phasemicroscopy.html

Microscope polarisant

P A

E sin (2µ) (ei'¡ 1)

0

¡ sin µ1

Mesure de la biréfringence

0

cos µ1

0

cos µ1

E0 sin (2µ) (ei'¡ 1)

2

0

@

¡ sin µcos µ

0

1

AE0

0

@

cos µsin µ

0

1

A E0

0

@

cos µsin µei'

0

1

A

I0 I0I0 sin2(2µ) sin2('=2)

Microscope polarisant

PMesure du pléochroïsme

0

cos µ1

0

cos µ1

E0

0

@

cos µsin µ

0

1

A

E0

0

@

cos µsin µe¡®

0

1

A

I0I0

¡

cos2 µ + sin2 µe¡2®¢

http://les.mineraux.free.fr/dossier-mineralo/lamemince/fiches/biotite.htm

Contraste par interférométrie

Image du relief

http://prn1.univ-lemans.fr/prn1/siteheberge/PublisCours-OPI/OPI_fr_M03_C04/co/Contenu42.html

Microscope DIC

± < r¶esolution

Image du gradient de la phase

“Differential Interference Contrast”

I / 1 + cos(¢' + '0)

gradient de phase

DIC ou Contraste de phase?

Objets Images de la phaseImages DIC

http://www.microscopyu.com/galleries/dicphasecontrast/index.html

Contraste de phase insensible aux pbs de polarisation ⇒ boite de PetriDIC utilisable avec des objectifs à forte NA ⇒ meilleur résolution

Contraste de fluorescence

Excitation Émission

Diagramme énergétique de Jablonski

Décalage de Stokes

Jablonski

https://www.omegafilters.com/curvo2/index.php?dyes=16&xmin=400Intérêts de ce contraste

• Possibilité de filtrer simplement le faisceau d’excitation et ne détecter que l’émission• Découplage de l’excitation et de l’émission• Rendement de fluorescence• Marquage spécifique

Défauts

• Photobleaching• Toxicité

Particularités

• Temps de désexcitation• Transfert d’énergie

Les luminophores

• Fluorophores exogènes intercalables, greffables (spécifique)…• Protéines chimériques (GFP…);• Billes fluorescentes (plus lumineux mais plus gros);• Fluorophores endogènes (moins lumineux);

• Nanocristaux de semi-conducteur (plus lumineux, moins de photobleaching mais blinking! et pb de greffache et de phototoxicité.

• Nano-diamants (plus stables, plus lumineux…)

Contraste de fluorescence (spectral)

Cellules de foie www.zeiss.de

2 (fausses)couleursDichroïque

Filtre DAPIFiltre rouge

Excitation à 360nm Émission

Miroir dichroïque

Excitation

détection

dét

ecti

on

filtres Noyau (DAPI) Cytosquelette

Contraste de fluorescence (temps de vie)

FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy)

Deux méthodes (Cf F. Sureau):• Time domain• Frequency domain

Permet de différencier 2 fluorophores qui ont même spectre d’émission

Images Sandrine Lévêque-Fort - Lab.de Photophysique Moléculaire

Contraste en microscopies cohérentes

• Génération de Second Harmonique (SHG)⇒ uniquement sur des matériaux non-centrosymétriques!

~P 2! = Â(2) ~E! : ~E!

ωωωω2ω2ω2ω2ω

SHG

ωωωω ωωωωf

2PF

Artère de rein fibrotiqueRouge:2PEFVert: SHG=>collagènehttp://www.lob.polytechnique.fr

30000

Intensity (counts)

THG

Image d’embryon de drosophileW. Supatto et al., PNAS (2005)

• Génération de Troisième Harmonique (THG)⇒ efficace sur les interfaces!

SHG 2PF

ωωωω 3ω3ω3ω3ω

THG

~P 3! = Â(3) ~E! : ~E! : ~E!

350 400 450 550 600 650

0

200

400

600

800

20000

30000

wavelength (nm)

Intensity (counts)

SHG

THG

TPF

Les microscopies de

fluorescencefluorescence

Microscopies de fluorescence

Échantillons spatialement incohérents!

Deux modes d’imagerie :

Cam

éra

Lampe

Condenseur

Imagerie en champ large

Lampe (incohérent)

Miroir dichroïque

Faisceau pompe (cohérent)

Photodiode

Trou confocalx

zy

Imagerie en mode confocal


Échantillons spatialement incohérents!

Deux modes d’imagerie : dz =n¸

NA2La profondeur de champ


Résolution vs Localisation

La localisation latérale est limitée par le bruit⇒ de l’ordre du nm avec 1 émetteur!⇒ Single Particule Tracking (SPT)

New directions in single-molecule imaging and analysis, W. E. Moerner, PNAS 104, 12596–12602, 2007

La résolution latérale est limitée par la diffraction⇒ de l’ordre de .¸=2

µ

J1 (k NA M r)

k NA M r

¶2


Résolution vs Grandissement

Image grandie 4 fois

Le grandissement M =ft

fo

M =ft

fo

La résolution 1:22¸

2NA

1:22¸

2NA

Image à faible grandissement

Image grandie 4 fois et 2 fois plus résolue

Le grandissement est important mais l’ouverture numérique de l’objectif l’est beaucoup plus!

2NA2NA


Résolution vs Grandissement

résolution de l’objectifrésolution de l’objectif

Attention à la taille du pixel!

M1; 22¸

2NA

Il faut adapter le grandissement à la taille du détecteur!

emission

excitation

camera

x

z


Mesure de l’orientation 3D

λ=525 nmNA=1,3 n=1.518 m=40

emission

excitation

camera

Conservation de l’information sur l’orientation de l’émetteur à travers le microscope

emission

excitation

camera

dipole

Image du dipole

focal plane

Conservation de l’information sur l’orientation de l’émetteur à travers le microscope

x

z

Imagerie défocalisée

-40

-20

0

20

40

Y (

µ m)

-40 -20 0 20 40

X ( µm)

60

40

20

0

(A.U

.)

Image du dipolesur l’orientation de l’émetteur à travers le microscope

emission

excitation

camera

-40

-20

0

20

40

Y (

µ m)

-40 -20 0 20 40

X ( µm)

30

20

10

0

(U.A

.)

dipole

Image du dipole

focal plane

Mais information difficile à lire!

x

z

150

100

50

0

-50

-100

-150

Y (

µ m)

1000-100

X ( µm)

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.20.0

(A.U

.)


emission

excitation

camera

L’imagerie défocalisée pour lire cette information!

emission

excitation

camera

focal plane

« image défocalisée» du dipole

10 mm

x

z

M. Böhmer & J. Enderlein, JOSA B 20 (2003)

150

100

50

0

-50

-100

-150

Y (

µ m)

1000-100X (µm)

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

(A.U

.)

A


A D. Patra, I. Gregor, J. Enderlein, J. Phys. Chem. A 108 (33) p. 6836-6841 (2004)

B E. Toprak et al., PNAS 103 (17) p. 6495-6499 (2006)

Les microscopies de

fluorescence à balayagefluorescence à balayage

Microscopie confocale de fluorescence

Dichroic mirror

Laser beam

Photodetector

NA

n

φfl

fobj

Main parametersMain parameters

• of the microscope : NA and the ratio φφφφ/M…

• of the excitation : mode, wavelength, polarization, shape of the beam…

• of the emission : wavelength…

3D-Resolution is defined by a volumetric function depending on the excitation, emission and collection parameters.

Volumes d’excitation (EEF)Excitation Efficiency Function (EEF)

LASER beamEEF = Carte 3D de l’intensité focalisée (1PF)

= Carte 3D de I2 (2PF)

NA=1,4 n=1,518λ1=400nm

E. Guiot, PhD Orsay Univ. (2001)

meilleure confocalité

Volumes de collection (CEF)Collection Efficiency Function (CEF)

600

400

200

0

-200

z (n

m)

100

80

60

40

CEF = Image 3D du trou confocal

=

-400

-600

-400 -200 0 200 400

r (nm)

20

Fluorescence

objective Tube lens pinhole

Carte 3D de l’intensité détectée enfonction de la position 3D de l’émetteurindividuel uniformément éclairé


600

400

200

0

-200

z (n

m)

100

80

60

40


=

-400

-600

-400 -200 0 200 400

r (nm)

20

Fluorescence




600

400

200

0

-200

z (n

m)

100

80

60

40


=

-400

-600

-400 -200 0 200 400

r (nm)

20

Fluorescence




600

400

200

0

-200

z (n

m)

100

80

60

40


=

-400

-600

-400 -200 0 200 400

r (nm)

20

Fluorescence



Volumes de détection (DEF)Detection Efficiency Function (DEF)

600

400

200

0

-200

z (n

m)

100

80

60

40

Focusing

Excitation

Emission

Collection

Fluorescent sample

LASER beam

Fluorescence

DEF=EEF X CEF

Focused beamImage of the

pinhole

-400

-600

-400 -200 0 200 400

r (nm)

20

Detection

ResolutionEEF CEF

Augmenter la résolution?

100

80

60

40

20

0

-2 -1 0 1 2

EEFCEFDEF

100

80

60

40

20

0

-2 -1 0 1 2

EEFCEFDEF

NA=0,6 φφφφ/M=1µµµµmλp=488nm λf=525nm

-2 -1 0 1 2

Axe X ( µm)

-2 -1 0 1 2

Axe X ( µm)

NA=0,6 φφφφ/M=0,3µµµµmλp=488nm λf=525nm

Le trou confocal doit être adapter à la fonction d’Airy

R = M1; 22¸

2NA

Augmenter la résolution?

100

80

60

40

20

0

-2 -1 0 1 2

EEFCEFDEF

100

80

60

40

20

0

-2 -1 0 1 2

EEFCEFDEF

NA=0,6 φφφφ/M=1µµµµmλp=488nm λf=525nm

-2 -1 0 1 2

Axe X ( µm)

NA=0,6 φφφφ/M=0,3µµµµmλp=488nm λf=525nm

-2 -1 0 1 2

Axe X ( µm)

Le trou confocal doit être adapter à la fonction d’Airy

R = M1; 22¸

2NA

Augmenter la résolution des

microscopes confocauxmicroscopes confocaux

Résolution axiale

TIRF microscopy(Total Internal Reflection Fluorescence)

I(z) = I0e¡z=d

d =¸

4¼p

n 2 sin2 µ ¡ n 24¼p

n12 sin2 µ ¡ n2

2

d ↘ quand λ↘ ou θ ↗

Résolution axiale

TIRF microscopy(Total Internal Reflection Fluorescence)

http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorescence/tirf/tirfconfiguration.html

Résolution axiale

Le θθθθ-microscopeEEF CEF DEF

X =z zz

Résolution axiale: le θθθθ-microscope

EEF DEF

CEF

Photodetector

Laser beam

Pb d’encombrement et de support d’échantillons!

Résolution axiale: 4ππππ-microscopie

Filtre Notch

Sténopé

Photodetecteur

FluorescenceLame semi-

réfléchissante

L

M

LASER

ObjectifsL

L Sténopé

Miroir dichroïque

Fluorescence

LASER

(a) S. W. Hell, EP0491289 (24-06-1992)

(b) C. J. R. Sheppard et al. Optik 87(3) (1991)

MM

Objectifs

(a)

Ldichroïque

(b)

Résolution axiale: 4ππππ-microscopie

Filtre Notch

Sténopé

Photodetecteur


réfléchissante

L

M

LASER

ObjectifsL

L Sténopé

Miroir dichroïque

Fluorescence

LASER

(a) S. W. Hell, EP0491289 (24-06-1992)


MM

Objectifs

(a)

Ldichroïque

(b)

Résolution axiale : 4ππππ-microscopie

Filtre Notch

Sténopé

Photodetecteur


réfléchissante

L

(a) S. W. Hell, EP0491289 (24-06-1992)


(c) A. Egner et al. Trends in Cell Biology 15(4) 2005

MM

Objectifs

(a)

(c) Fibres d’actines

CEF d’un 4ππππ-microscope

Axe optique (z)

Fluorophore dipolaire

Foyers

λ=525 nm

NA=1,3 n=1.518 m=40

φ=20 µm

CEF d’un 4ππππ-microscope

Axe optique (z)

Fluorophore dipolaire

Dipôle fictif cohérent

Foyers

λ=525 nm

NA=1,3 n=1.518 m=40

φ=20 µm

Résolution axiale: le 4ππππ-microscope

Lobes secondaires trop intenses

Pas de gain sur la résolution latérale

Images of a pair of actin fibers

A. Egner et al. Trends in Cell Biology 15(4) 2005

EEF= Carte 3D du carré de l’intensité du faisceau pompe focalisé Excitation Émission

Régime d’absorption à 2 photons

λ =488 nm

4ππππ-microscopie et excitation 2PE

λpompe1=488 nm

λpompe2=2x488 nm

λfluo=525 nm

β=0.1

Polarisation selon X

NA=1,3 n=1.518

Φ=20 µm m=40

EEF= Carte 3D du carré de l’intensité du faisceau pompe focalisé Excitation Émission


λ =488 nm


λpompe1=488 nm

λpompe2=2x488 nm

λfluo=525 nm

β=0.1


NA=1,3 n=1.518

Φ=20 µm m=40

Excitation Émission


λ =488 nm

Lobes secondaires

moins intenses


λpompe1=488 nm

λpompe2=2x488 nm

λfluo=525 nm

β=0.1


NA=1,3 n=1.518

Φ=20 µm m=40

Perte sur la résolution latérale

optical axis(z)

Fluorophore

Focus

Résolution latérale: le 4ππππ’

λ=525 nm φ=20 µm

NA=1,3 n=1.518 m=40

S. Hell, “Double-confocal scanning microscope,” European Patent EP0491289 (1992, filed dec. 18 1990).

optical axis(z)

FluorophoreCoherent dipole

Focus


λ=525 nm φ=20 µm

NA=1,3 n=1.518 m=40

S. Hell, “Double-confocal scanning microscope,” European Patent EP0491289 (1992, filed dec. 18 1990).

optical axis(z)

Fluorophore

Focus

Coherent dipole


λ=525 nm φ=20 µm

NA=1,3 n=1.518 m=40 N. Sandeau, H. Giovannini, J. Opt. Soc. Am. A 23, 1089-1095 (2006).

Résolution 3D: le STED

Stimulation

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(15): 8206-8210 (2000).

Excitation

Principe des microscopies

non linéaires et/ou non linéaires et/ou

cohérentes

ωωωω1111ωωωωf

Fluorescence excitée à 1 ph.

1PF

ωωωω2222

ωωωωf


2PF

ωωωω2222

ωωωω3333

ωωωωf


3PF

ωωωω3333

ωωωω3333


Génération 2nd

Harmonique.


Fluorescence Signaux cohérents

ωωωω

ωωωω

ωωωω

Signaux non linéaires

1PF 2PF 3PF

350 400 450 550 600 650

0

200

400

600

800

20000

30000

Longueur d’onde(nm)

Intensité (U.A.)

SHG

THG

Fluo

Harmonique.SHG Génération 3ème

Harmonique.THG

Uniquement sur les objets non centro-

symétriques (Collagène)

Efficace sur les interfaces (membranes)


1PF

ωωωω2222

ωωωωf

2PF

ωωωω2222

Avantages:• confocalité• pénétration dans les tissus (- de diffusion)


400nm

continu

800nm

impul-

sionneldiffusion)• + grand écart entre excitation et émission

Inconvénients:• sources à impulsions courtes (Prix, spectre…)

1 photon 2 photons

sionnel

W. R. Zipfel et al. Nature Biotech. 21 (2003)


1PF

ωωωω2222

ωωωωf

2PF

ωωωω2222



diffusion)• + grand écart entre excitation et émission


Rein de singe profondeur 60 µmexc 750nm, NA 1.2

V. E. Centonze et al. Biophys. J. 75 (1998)


1PF

ωωωω2222

ωωωωf

2PF

ωωωω2222



2PE1PE

95 nm 305 nmdiffusion)• + grand écart entre excitation et émission


95 nm

Spectre 2PE sur tissu pulmonaire non marquéExcitation à 800 nm


1PF

ωωωω2222

ωωωωf

2PF

ωωωω2222



diffusion)• + grand écart entre excitation et émission



SHG

ωωωω

(signal cohérent)

Sur objet non centro-symétrique

Signaux Cohérents

Sensible à l’ordre et à l’orientation des molécules

Spectre 2PE sur tissu pulmonaire non marquéExcitation à 830 nm

SHG image of fibroblast cell labeled by Di8LPQM Collaboration with The Ben-Gurion University (L. Amire, R. Marx)

Microscopies cohérentes : ex la SHG

Coherent induced dipoles

Local excitation field ( )zyxE ,,ω

�

( )zyxP NL ,,2ω

�

( ) ( ) ( )zyxEzyxEzyxPNL ,,:,,:,, )2(22 ωωωω χ

��

=

( ) ( ) ( )zyxEzyxEzyxPNL ,,:,,:,, )2(22 ωωωω χ

��

=

Vpm

Vpm

Vpm

Vpm

Vpm

/9.16

/4.4

/5.2

/6.3

/9.1

)2(33

)2(32

)2(31

)2(24

)2(15

≈

≈

≈

≈

≈

χχχχχ

Potassium Titanyl Phosphase -KTiOPO4


Vpm /9.1633 ≈χ

We define the KTP orientation by the Euler

angles (θ, ϕ, ψ)(θ, ϕ, ψ)(θ, ϕ, ψ)(θ, ϕ, ψ)

ψθ

ϕ

1111

2222

X

Y

Z

x y

z

3333χχχχ(2) of massive KTP

Le signal de SHG dépend du champd’excitation et de l’objet (orientation,taille…)!

-40

-20

0

20

40

x n

m

-40 -20 0 20 40

z nm

250200150100500

-20

0

20

40

y n

m

250200150100500

200

100

0

-100

-200

x n

m

2000-200

z nm

600

400

200

0

x10

3

200

100

0

-100

y n

m

6005004003002001000

x10

3

-200

-100

0

100

200

x n

m

-200 0 200

z nm

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

x10

6

200

100

0

-100

y n

m

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

x10

6


10 nm long side 70 nm long side100 nm long side

-40

-40 -20 0 20 40

z nm

0 -200

2000-200

z nm

1000

-200

2000-200

z nm

0.0

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

Inte

nsi

ty (

A.U

.)

400300200100

sides length (nm)

ForwardEpi x 100Epi/ForwardKTP along X axis

Euler angles:

θθθθ=90°°°°, ϕ, ϕ, ϕ, ϕ=0°, ψψψψ=0°

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