Conlp. hnmun. Mic'rohiol. it?/i,(l. Dis. Vol. 6. pp. 95 99, 1983 0147-9571 83'010095-05503.00'0 Printed in Great Britain. All rights reserved Copyright © 1983 Pergamon Press Ltd

MISE EN EVIDENCE DES CELLULES "NATURELLES TUEUSES" (NK) CHEZ LE LOUP D'ELEVAGE

(DICENTRARCHUS LABRAX). INFLUENCE DE LA TEMPERATURE D'ELEVAGE

P. DESCHAUX*, L. PERROY-CORDIER* et G. PERESt

*Laboratoire d'Immuno-Physiologie, U.E.R. des Sciences, Universit6 de Limoges, 123 Avenue Albert Thomas, 87100 Limoges, France

+Laboratoire maritime de Physiologie (lnstitut Michel Pacha) de l'Universit6 Claude Bernard Lyon 1, Corniche de Tamaris, 83500 La Seyne sur Met, France

(Recu le 8 ]~;crier 1982)

R6sum6 Nous avons 6tudi6 l'influcncc de la temp6rature sur les cellules naturelles tueuses du Loup d'~levage (Dicentrarchus lahrax). Les r6sultats obtenus m civo d6montrent l'existence de ces cellules tueuses chez l'esp6ce 6tudihe. Leur cytotocicit6 est maximale lorsque les animaux sont 61evhs 8 18°C. hi vitro nous avons obtenu une activit6 NK maximale ~_ une temperature de culture cellulaire comprise entre 18 et 21C.

Mots-clefs: Loup, cellules naturelles tueuses, temperature

E V I D E N C E F O R N K CELLS IN D I C E N T R A R C H U S L A B R A X . A C T I O N O F B R E E D I N G T E M P E R A T U R E

Abstract The role of temperature on NK cells was studied in the spleen of a fish (Dicentrarchus lahrax). NK cells presence was demonstrated with a maximal cytotoxicity when animals were maintained at 18C. An in citro study confirmed these results.

Key words: Fish (Dicentrarchus lahrax), NK cells, temperature

I N T R O D U C T I O N

Dans les 61evages, le poisson est plus sensible aux agressions virales et bact6riennes lorsque la temperature de l'eau est relativement basse [1]. De nombreuses recherches ont et6 men6es concernant l'influence de la temp&ature d'61evage sur les moyens de d6fense naturelle et sp6cifique du poisson [1-7].

La synth6se et la lib6ration des anticorps circulants sont des ph6nom6nes d6pendants de la temp6rature, les basses temp6ratures ralentissent ces processus sans les inhiber compl6tement [5].

Peu de travaux concernent l'influence de la temp6rature sur les moyens de d6fense non sp6cifiques du poisson. Chez le Mammif6re une fonction immune non sp6cifique a 6t8 d6couverte r6cemment: l'activit6 naturelle tueuse [8]. Le support cellulaire de ce moyen de d6fense est repr6sent6 par les cellules naturelles tueuses (NK).

Nous avons recherch6 la pr6sence de ces cellules chez le Loup et l'influence de la temp6rature d'6levage sur leur pouvoir cytotoxique.

Parall~lement une ~tude in vitro a 6t6 r6alis6e; les cellules N K isol6es ft. partir de N K de poissons 61evOs 8 13°C sont raises en culture ik diffOrentes temphratures et leur activit6 cytotoxique estim6e.

95

96 P. DESCHAUX et al.

MATERIELS ET METHODES

Animaux et conditions d'dlevage

Notre travail a 6t6 r6alis6 sur le Loup (Dicentrarchus labrax). Les animaux "hg6s d'un 6t6 sont fournis par la station Deva-Sud du Cnexo de Palavas les Flots (France) et transport6s au laboratoire maritime de Physiologie de Tamaris sur Mer (France). Les poissons sont 61ev6s en semi libert6 dans des bassins clos & renouvellement permanent en eau de mer; ils seront utilis6s apr6s quatre semaines d'adaptation & ces nouvelles con- ditions.

Un syst6me de r6sistances chauffantes permet une r6gulation thermique ~, +_ 0,5~C dans les bacs.

L'exp6rimentation in vivo a 6t6 r6alis6e au mois de Janvier sur des lots de poissons acclimat6s pendant 4 semaines respectivement ~ 13, 18 et 21°C. Les essais in vitro ont 6t6 conduits en F6vrier & 4 temp6ratures: 8, 18, 21 et 37°C avec des cellules spl6niques de poissons acclimat6s ~t 13~:C.

Milieux de culture

Les cultures cellulaires sont r6alis6es dans du milieu RPMI (Biomerieux) additionn6 de 10~o de s6rum de veau foetal, de tampon h6pes (15 mM) et de 1°,/, d'un m61ange de streptomycine-penicilline; le pHes t ajust6 & 7,2.

La r6colte et la pr6paration des cellules se font dans du milieu RPMI additionn6 d'antibiotiques.

Cellules allogdniques cibles

Nous avons utilis6 la souche cellulaire L (cellules tumorales de la lign6e de souris C3H); cette souche cellulaire est entretenue soit in vivo sur les souris C3H, soit in vitro par repiquages successifs [9].

Recherche de la cytotoxicitd naturelle

(A) Etude in vivo. Pr@aration des cellules NK

Cellules effectrices. Les poissons 61ev6s aux diff6rentes temp6ratures pendant 4 semaines (13, 18, 21°C) sont sacrifi6s par fracture cervicale. Les rates sont pr61ev6es et 6cras6es pour la pr6paration des cellules effectrices NK. Apr6s plusieurs lavages de la suspension cellulaire dans le milieu RPM! nous 61iminons les globules rouges par choc h6molytique et les lymphocytes Be t les macrophages par passage sur colonne de nylon activ6 [10]. La suspension cellulaire obtenue est ajust6e "h 107 cellules vivantes/ml darts du milieu complet.

Pr@aration des cellules cancdreuses Les cellules L sont r6colt6es par trypsination ~ partir d'une bo]te de culture. Apr6s 2

lavages successifs, le culot est repris dans 1 ml de milieu RPMI complet (20 x 106 cellu- les/ml) auquel on additionne 0,05ml d'une solution de chrome 51 (CEA Saclay) (2 mCi/ml). Apr6s incubation & 37°C pendant 1 hr, la suspension cellulaire est centrifug6e, le culot lav6 2 lois et repris avec du milieu RPMI complet; la concentration finale cellulaire est 6gale ~ 10 6 cellules/ml.

Le test de microtoxicit6 est r6alis6 dans des bo]tes Greiner 96 trous. Darts chaque trou sont d6pos6s 0,I ml de suspension lymphocytaire et 0,1 ml de cellules canc6reuses (rap-

Mise en evidence des cellules "'naturelles tueuses" (NKI 97

port cellules effectrices/cellules cibles = 20/1). Nous realisons 6 trous de microculture par poisson.

Le temoin de 'lyse maximale' est obtenu en melangeant 0,1 ml de suspension de cellules cancereuses marquaes et 0,1 ml d'une solution de sodium dodecyl sulfate fi 1% (SDS); nous realisons 6 trous de microculture.

Le temoin de 'lyse minimale' est obtenu en additionnant 0,1 ml de suspension de cellules cancdreuses marquees "5. 0,1 ml de milieu RPMI complet; comme dans le cas precddent nous rdalisons 6 trous de microculture.

Les bo'ites de culture sont disposdes dans un incubateur (atmosphere CO2 5%-02 95~0; tempdrature 25°C). Apres 24 hr d'incubation, les bo'ites sont centrifugees (300y, 5 mini, le surnageant de chaque trou est rdcuper6 et la radioactivit6 ddterminde. Le pourcentage de lyse sera exprim6 par le rapport

pourcentage de lyse = Cpm essai - cpm temoin milieu

Cpm SDS - cpm temoin milieu x 100.

(B) Etude in vitro. Les poissons sont 61eves/t 13cC (temperature ambiante au mois de Fevrier). Apres sacrifice de 50 Loups, on preleve les rates et on prepare les cellules NK selon le meme protocole que pour l'etude in vivo.

Le contact cellules effectrice~cellules cibles qui, dans l'etude in vivo 6tait fait fi 25~C, est realis6 dans cette etude in vitro ~ 8, 18, 21 et 37°C pendant 24 hr.

Les pourcentages de lyse maximale et rninimale sont calcules comme precedemrnent. Pour chaque temperature nous avons realis6 30 microcultures.

R E S U L T A T S

Etude in vivo (Tableau 1)

Nous avons exprim6 la quantit6 de chrome relargu6 et le pourcentage de cytotoxicit6 des cellules NK. L'activit6 cytotoxique est maximale lorsque les animaux sont 61eves ft. la temperature de 18°C.

Tableau 1. Effet de la temperature d'61evage sur la cytotoxicit6 des cellules naturelles tueuses (NK) chez le Loup (Dicentrarchus labrax)

Significativite Temperature comparaison entre

d'61evage Cpm chrome 51 Pourcentage les differentes des Loups relargue/10 6 de temperatures

(°C) cellules cytotoxicite (~C)

13 1487" + 11 6,87 (18) P < 0,01 N t = 13 (21') P < 0,001

18 11903 + 223 38,5 (21 ° ) P < 0,001 N = 2 3

21 2952 + 58 7,7 N = 3 5

* Cytotoxicite exprimee en cpm; X + S.E.M. t N = n o m b r e de poissons sacrifies par temperature,

98 P. DIS('HAUX ('l a/.

Tableau 2. Effet de la temperature d'incubation des cultures sur la cs, totoxi- cit6 des cellules naturelles tueuses (NK) provenant de Loups d'~lewlge

Temp6rature d'incubation Significativit6 des cultures Cpm chrome 5~ Pourcentage comparaison entre cellulaires relargu6/10 ~' de les diff6rentes

(C) cellules cytotoxicit6 temperatures

8 593* ± 5,9 13,03 ~\'t = 30

18 646 ± 13,5 27 N - 30

21 623 + 5,9 21 N - 30

37 607 ± 8,6 16 N - 30

(18)P <0.001 (21)P <0.001

(37') NS (21') NS

(37)P <0,01 (37) NS

* Cytotoxicil6 exprimee en cpm: x + S.E.M. 5,' =nombre de microcultures.

Etude in vi tro (Tableau 2)

Le m a x i m u m de cytotoxici t6 est obtenu lorsque la t empera tu re de cul ture est compr i se

entre 18 et 21 C .

DISCUSSION

Le syst6me immuni ta i re du poisson a fait l 'objet de nombreuses e tudes po r t a n t sur la phylog6nie des esp6ces.

Actue l lement la mul t ip l ica t ion des 61evages or iente les recherches vers les moyens de s t imula t ion des d6fenses immunes pour intervenir r ap idemen t lors d ' infect ions virales ou

bact6riennes. Not re 6rude a port6 sur un syst6me de d6fense cel lulaire non sp6cifique du Loup en

61evage 5.g6 d 'un 6t6: les cellules naturel les tueuses [8]. Ces cellules, pr6sentes dans la rate, ne peuvent pas ~tre class6es parmi les lymphocytes . Cer ta ins au teurs les consid6rent comme des lymphocy tes pr6 T car elles peuvent ~tre stimul6es par les h o r m o n e s thymi- ques [ 1 1 ].

Nos r6sultats mon t ren t la pr6sence de cellules N K dans la rate du Loup. Pour met t re en 6vidence ces cellules nous avons 61imin6 les lymphocy tes B p roduc teu r s d 'an t icorps , ce qui exclut route r6ponse 'ki l ler ' an t icorps d6pendante .

L'act ivi t6 'na ture l le tueuse ' est max imale lorsque les an imaux sont 61ev6s fi 18"~C (Tab- leau 1). L ' inf luence de la t emp6ra ture sur la fonct ion de ces cellules est confirm6e par Fexp6r imenta t ion in vitro (Tableau 2). Cependant , dans cette 6tude, nous n 'avons pas s6par6 le r61e de la t emp6ra ture sur les cellules N K et les cellules cibles; les r6sultats expr iment l ' intensit6 de la r6act ion cellules effectrices-cellules cibles en fonct ion de la temp6ra ture de culture.

I1 ne semble pas y avoir de pub l ica t ion conce rnan t l ' immuni t6 du Loup d'61evage. L 'existence d 'une r6ponse humora le et d 'une r6ponse cel lulaire a cependan t 6t6 d6montr6e chez d 'au t res esp6ces [-12 15]. De nombreuses con t rad ic t ions pers is tent fi p ropos de l ' influence de la temp6ra ture sur l ' immuni t6 du poisson. Elles sont la cons&

Mise en 6vidcnce des cellules "'naturelles tueuses" (NKI 99

q u e n c e d ' u n e i n su f f i s ance de c o n n a i s s a n c e s sur les p a r a m 6 t r e s de la r d p o n s e i m m u n e . Le

d 6 r o u l e m e n t de cel le-ci n6cess i t e l ' i n t e r v e n t i o n de n o m b r e u x 616ments c e l l u l a i r e s ; se lon

n o u s , c 'es t au n i v e a u de la r d p o n s e de c h a c u n de ces 616ments q u e do i t ~tre 6 tud ide

F a c t i o n de la t e m p d r a t u r e .

E n ce qu i c o n c e r n e les ce l lu les N K , la m e m b r a n e j o u e le r61e p r i n c i p a l dar ts l eur m o d e

d ' a c t i o n . I1 y a r e c o n n a i s s a n c e de l ' a g e n t 6 t r a n g e r p a r des r d c e p t e u r s de m e m b r a n e , pu i s

d e s t r u c t i o n de ce d e r n i e r p a r lyse a p r e s fus ion des m e m b r a n e s . C ' e s t a u n i v e a u de la

s t r u c t u r e m e m b r a n a i r e q u e n o u s r e c h e r c h o n s a c t u e l l e m e n t l 'effet de la t e m p d r a t u r e sur

les ce l lu les N K .

Remerciemems Ce travail b6n6ficie d'un contrat CNEXO no. 8(>2284. Les auteurs remercient Monsieur A. Rigal pour son aide technique.

R E F E R E N C E S

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