New Thin-Layer Materials for Water-Soluble Substances

Neue Dennschicht-Materialien wasserl6sliche Stoffe

Nouveaux materiaux en chromatographie sur couche mince pour des substances solubles dans.l'eau

G. Hesse / H. En.qelhardt / R. Kaltwasser* Institut for Organische Chemie der Universit&t Erlangen-NOrnberg, D-852 Erlangen, HenkestraBe 42

Summary: Polyacrylnitrile, Polyacrylic acid amide, and N-Acetyl-polyaerylic acid amide were investigated as new sorbents for TLC. Their properties are compared with each other, as weU as with Polyamide (Woelm). The materials are finely powdered substances giving very good adhering layers on glass-plates, using alcoholic suspensions. They are suitable for the separation of water-soluble sub- stances, being able to form hydrogen-bonds, especially with acids (aminoacids, dicarboxilic acids, sulfonic acids) and particulary of sugars. The mechanism of the separa- tion is discussed.

Zusammenfassung: Polyacrylnitril, Polyacryls~iureamid und N-Acetyl-Polyaerylsaureamid werden al~ neue Sorben- tien ftir die DC untersucht und ihre Eigenschaften unter- einander und mit denen von Polyamid (Woelm) vergliehen. Die Materialien sind feink6rnige Substanzen und geben aus alkoholischer Suspension auf Glas gut haftende Schichten. Sic eignen sich zur Trennung yon wassefl6slichen Stoffen, die Wasserstoffbindungen bilden, insbesondere yon ~uren (Aminos/iuren, Dicarbons~uren, Sulfons~uren) und be- sonders yon Zuckern. Auf den Mechanismus der Trennung wird besonders eingegangen.

Sommaire: Le polyacrylonitrile et les polym6res de l'amide acrylique et de l'amide N-acdtyl-acrylique ont 6td examinds en rue de leur emploi comme adsorbants pour la chromatographie sur couche mince. Leurs quali- tds ont dtd compardes entre eux et avec celles du poly- amide Woelm. Ces matdriaux sont des substances pul- vdrulentes de granulation fine. Utilisds en suspension alcoolique, ils donnent des couches bien adh6rentes au verre, lls sont utiles pour la sdparation de substances solubles darts l'eau et capables de donner des liaisons hydrog6nes, en particulier des acides (aminoacides, acides dicarboxyliques, acides sulfoniques) et surtout des sucres. Le mdcanisme de la s~paration est ddcrit en ddtail.

*) Zulassungsarbeit fiir die Wissenschaftliche Priifung f0r das Lehr- amt an H6heren Sehulen, Univ. Erlangen-Niirnberg 1967.

Besonders in der Biochemie hat man es oft mit Gemischen wasserl6slicher polarer Stoffe zu tun, die sich haupts~chlicla durch die Zahl und Anordnung ihrer funktioneUen Grup- pen unterscheiden. Ftir diese Aufgabe ist die Dtinnschicht- chromatographie noch verl~ltnism/it~ig wenig ausgebaut. Sic wird vorwiegend als Verteilungsverfahren ausgeftihrt. Man kann aber erwarten, da~ aUe Unterschiede, die nur auf verschiedener Anordnung der gleichen funktionellen Gruppen beruhen, gegentiber einer einseitig wirksamen Oberfl~che starker zur Geltung kommen als in der L6slich- keit, denn das L6sungsmittel hat Zutritt yon allen Seiten her. Als Adsorptionsmittel, die noch in wasserhaltigen Medien wirksam bleiben, stehen die Polyamide zur Verfti- gung [ 1, 2, 3], die tiber die Bildung yon Wasserstoffbrticken wirksam werden. Sie eignen sich ftir die Trennung yon Phenolen, S/iuren, Gerbstoffen und verschiedenen anderen Naturstoffen, besonders Glycosiden.

Die im Handel erh~ltlichen Polyamide (Macherey-Nagel, Merck und Woelm) sind umgefallte Nylon- oder Perlon- Sorten. Die Amidgruppen sind also in die Polymerkette eingebaut und haben verh~ltnism/it~ig grol~e Abst~nde von- einander. Wir haben aus Polyacrylnitril durch vorsichtige Verseifung der zug/inglichen Nitrilgruppen mit alkalischem Hydroperoxid [4] ein Polyaeryls/iureamid erhalten, das prim~ire S~ureamidgruppen in 1,3-Stellung an einer unver- zweigten Paraff'mkette enthalt. Im IR-Spektrum (KBr- Pref~ling) ist diese Gruppierung durch das Auftreten der Saureamidbanden im Bereich yon 1590--1720 cm -t , die dem Ausgangsmaterial fehlen, zu erkennen. Da das Licht auch das Innere der Polymerk6rner durchsetzt, ist daneben die Nitrilbande etwas abgeschw~cht vorhanden. Ein Tell dieses Materials wurde in einem Pyridin-Dimethylformamid" Gemisch mit Essigs~ureanhydrid an der Amidgruppe acety- liert. Dieses N-Aeetyl-Polyaeryl~ureamid entl~lt 0,3-0,35 % Acetylgruppen. In unsere Untersuchung wurde auch das Ausgangsmaterial Polyaeryls/iurenitril (PAN Farbenfabrikea Bayer mit M 45.000-50.000) einbezogen, da es nach den Erfahrungen mit den ,,Nitrilphasen" in der Gas-Chromato- graphic interessant erschien. SchliefSlich wurde zum Ver- gleich Polyamid Woelm (Nylon 66) herangezogen.

302 Chromatographia 1, 1968 Original

1. Aminos~iuren Bei den Aminos~iuren besteht zwar kein Mangel an gut aus- gearbeiteten Analysenmethoden, aber als gut bekannte Stoffklasse konnte man an ihnen am schneUsten Auskunft tiber die Aussichten der neuen Trennmethode erwarten. Dart~berhinaus ist die Kenntnis ihres Verhaltens gegenOber Amidbindungen yon biochemischem Interesse. Verwendung fanden 10 Aminos/iuren (vgL Fig. 1), yon denen jeweils 1 mm a einer 0 ,1% L6sung in Wasser aufgetragen wurde.

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Fig. l

Rf values of amino-acids on polyacrylie acid amide (A) and N-acetyl-polyacrylJc acid amide (B) with n-butanol (80 ml) and 10 (I), 15 (1I), 20 (III), and 25 (IV) ml of 30 % ammonia in aqueous solution. NLeu = Norleucine, Leu = Leucine, lieu = Isoleucine, Val = Valine, NVal = Norvaline, Meth = Methionine, 7Arab = 7-Amino- butyric acid, 13Ala = ~-Alaninc, Set = Serine, Glu = Glutamin acid

Rf-Werte yon Amino~ttren an Polyacryl~ureamid (A) und N-Acetyl-Polyacryls~iureamid (B) mit n-Butanol (80 ml) und 10 (I), 15 (11), 20 (III) und 25 (IV) ml 30 %iges w~issriges Am- moniak. NLeu = Norleucin, Leu = Leucin, lieu = Isoleucin, Val = Valin, NVal = Norvalin, Meth = Methionin, 7Amb = 7-Aminobutter- saute,/3Ala = J3-Alanin, Ser = Serin, Glu = Glutamins~iure.

Valeurs de Rf pour les acides amines d'acide polyactylique (A) et amide d'acide N-ac~tyl-polyacrylique (B) avec N-butanol (80 cm 3) et 10 (I), 15 (II), 20 (liD, et 25 (IV) cm a d'ammoniaque (30 % en solution aqueuse). NLeu = Norleucine, Leu = Leucine, Ileu = Isoleucine, Val = Valine, NVal = Norvaline, Meth = M~thionine, 7Amb = acide "y-aminobu- tyrique,/3Ala = ~-Alanine, Ser = Sdrine, Glu = Acide glutamique.

Der Nachweis auf der Platte erfolgte durch Besprtihen mit Ninhydrinreagenz und anschliet~endes Erw/irmen auf 110-120 ~ im Trockenschrank. Als einziges Fliet~mittel- gemisch, das eine Trennung ohne jegliche Schwanzbildung (Tailing) ergibt, fanden wir n-Butanol mit wechselnden Mengen 30 % Ammoniak. Verwendet wurden 80 ml n- Butanol mit 10(I), 15(II), 20(III), und 25(IV) ml Ammo- niak (30 %ig). Versuche mit h6herem Ammoniakgehalt brachten keine Verbesserung mehr.

An PAN und Polyamid Woelm ist die Sorption zu gering. Die Rf-Werte liegen daher durchweg in der oberen Platten- h~lfte und die Trennung ist mangelhaft Auf~erdem war bei Glutamins~iure bzw. Glutamins~ure und Norleucin das Tailing nicht zu beseitigen. Die beiden anderen Sorptions- mittel ergaben aber gute Trennungen mat den Gemischen II bis IV. Die Verteilung der Aminos~uren auf dem Chromato- gramm mit den verschiedenen Laufmitteln zeigt Fig. 1.

Die Vetsuche ergeben zun/ichst, dab die Aktivit/it der unter- suchten Sorptionsmittel in der Reihenfolge Polyacrylnitril < Polyamid < Acetylpolyacryls~iureamid < Polyacryl- saureamid ansteigt, wobei allerdings der Unterschied zwischen den beiden letztgenannten sehr gering ist. Mit der Erhohung des hydrophilen Anteils des Laufmittel- gemisches steigen die Rf-Werte leicht an. Durch den Zusatz yon Ammoniak wird dabei gleichzeitig eine zunehmende Verkleinerung der Substanzflecken beobachtet. Die Reihen- folge der Aminos~iuren ist die gleiche wie bei der Verteilungs- chromatographic an MadreUschem Salz [ 5], doch liegen die Rf-Werte welter auseinander und nutzen den ganzen Be- reich zwischen 0,02 und 0,80, so da~ sehr gute Trennungen m6glich sind. Der geringe Einflut~ des Wasserzusatzes und alas gleichartige Verhalten der sehr unterschiedlich hydro- philen Amide sprechen dagegen, dag Verteilungsvorg/inge eine wesentliche RoUe bei tier Trennung spielen; man mtit~te sonst beim Acetylderivat durchweg wesentlich h6here Rf-Werte erwarten. Bei sehr geringem Ammoniak- zusatz konnen Umstellungen vorkommen, beispielsweise bei den Paaren Norvalin-Valin und Methionin-.y-Amino- buttersiiure. Im Gemisch I sind die Rf-Werte durchweg wesentlich nie&iger, w~ihrend sic bei h6heren Ammoniak- konzentrationen sich nur noch wenig/indern. Wahrschein- lich werden die Aminosiiuren bei ausreichender Basen-

konzentration nur noch tiber die Aminogruppe des Anions gebunden, bei geringerem Ammoniakgehalt zus/itzlich tiber die Carboxylgruppe. Dies ist sicher bei der Glutamins~ure der Fall, die den niedrigsten Rf-Wert hat. Wenn der Wasser- gehalt der Fliet~rnittel stark erh6ht wird, werden aUe Rf- Werte gr6fSer und rticken dadurch n/iher zusammen. Das Wasser wirkt dann als Verdr/ingungsmittel, da es selbst Wasserstoffbindungen eingehen kann. Im Zellgeschehen kOnnten die im Wasser vorhandenen Sahionen eine ~hnliche Rolle bei Adsorptionsvorg/ingen spielen wie hier das orga- nische L6sungsmittel Butanol.

2. Dicarbons/iuren Auch die homologen Dicarbons/iuren yon der Oxals~iure bis zur Sebazinsaure lassen sich nur aus basenhaltigen Fliefl,- mitteln gut trennen, wobei die Menge und die St~rke der

Chromatographia 1, 1968 Original 303

Base einen erheblichen Einflut~ haben. Als FlieSmittel wurden 80 ml n-Butanol mit 200) , 25 ( I0 und 30(111) ml einer 30 %igen w~ifrigen Meflaylaminl6sung verwendet. Die Verteilung der DicarbonNuren auf den Chromato- grammen zeigt Fig. 2.

Abgesehen yon Oxals~ure, die stets am Start zurtickbleibt, erkennt man eine Zunahrne der Aktivitgt der Sorbentien in der Reihenfolge PAN < Nylon 66 < N-Acetyl-Polyacryl- Nureamid < Polyacryls~ureamid. Dementsprechend ist PAN in allen FNlen zur Trennung ungeeignet; Nylon 66 gibt mit Gemisch I noch eine gute Trennung der niederdn Glieder bis zur Pimelins/iure. ;~hnlich verhla'lt sich das acetylierte Polyacryls/iureamid bei allen drei Mischungen. Polyacryl- s~ureamid gibt in allen Fgllen eine fast lineare Abh~ingigkeit der Rf-Werte yon der Kohlenstoffzahl und daher ausgezeich- nete Trennungen. Im allgemeinen wird man auch bier dem Gemisch I den Vorzug geben.

Gute Trennungen an Polyacryls/iureamid erh/ilt man auch mit dem Flief~mittel Butanon-Isopropanol-30 % Ammoniak 25 : 45 : 15. Dutch besonders scharf begrenzte runde Flecke zeichnet sich das Gemisch n-Propanol-Benzol-30 % Ammo- niak-Triton B in den Verh/iltnissen 50 : 5 : 15 : 3 und 50 : 5 : 10 : 5 aus. Die beiden Polyacryls~ureamide unter- scheiden sich dabei kaum; alas zweite Mischungsverh~ltnis gibt durchweg niedrigere Rr-Werte, was vielleicht auf den geringeren Wassergehalt zuriJckzufiihren ist.

3. S u l f o n s ~ u r e n

Die Trennung yon einigen aromatischen Sul fon~uren an Polyamid wurde mit Wasser, Wasser-Methanol und reinem Methanol als Laufmit tel beschrieben [6]. Dies spricht wie- der gegen einen Verteilungsmechanismus und hat uns zu dem Versuch ermutigt, die L6sungsmittel der eluotropen

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Rf-Werte yon Dicarbons~uren an Polyacrylnitril (A),Nylon 66 {B), Polyaeryls~ureamid (C) und N-Acetyl.Polyacryls~ureamid (D) mit n-Butanol (80 ml) und 20 (I), 25 (II) und 30 ( l id ml einer 30 %igen w~issrigen MethylaminlSsung. Ma = Malons~iure, Be = Bernsteins~iure, GI = Glutar~ure, Ad = A d i p i n ~ e , Pi = Pimelins~ittre, Ko = Korks~ure, Az = Azelain- ~ure, Se = Sebazinsgure. Oxals~iure bleibt in allen Systemen am Startiqeck.

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Be

1 Rf values of dicarboxylic acids on polyacrylonitrile (A), Nylon 66 �9 (B), polyacrytic acid amide (C), and N-acetylpolyaerylic acid

amide (D) with n-butanol (80 ml) and 20 (I), 25 (II), and 30 (III) ml of 30 % methylamine in aqueous solution. Ma = malonic acid, Be = suecinie acid, GI = glutaric acid, Ad = adipic acid, Pi = pimelic acid, Ko = subedc acid, Az = azelaic acid, Se = sebacic acid. In all systems, oxalic acid remains on the initial spot.

Valeurs Rf d'acides dicarboxyliques sur polyacrylnitrile (A), Nylon 66 (B), amide d'acide polyacrylique (C), et amide d'acidc N-ac6tyl-polyacrylique (D) avec N-bu,tanol (80 cm 3) et 20 (1), 25 (II), et 30 (III) cm 3 de 30 % de methylamine en solution aquouso. Ma = acide malonique, Be = aeide suceinique, G1 = acide glutarique, Ad = acide adipique, Pi = aeide pim6llque, Ko = acide sub~rique, Az -- acide az61aique, Se = acide s6bacique. Dans tousles syst~- mes, l'acide oxalique reste sttr la tache initiale.

304 Chxomatographia 1, 1968 Original

Reihe auf ihre Elutionswirkung fur Sulfons~uren an Poly- acrylamid zu untersuchen. Dazu wurden die Ammonium- salze yon Benzolsulfons~ure und p-Toluolsulfons~ure au f Di~nnschichtplatten mit N-Acetyl-Polyacryl~ureamid auf- getragen und die Trennung mit den reinen L6sungsmitteln durchgeftihrt. Meist ergab sich ein starkes Tailing (T), so dat~ nur die oberen Enden der langgezogenen Flecken mit der Laufstrecke des Flief~mittels in Beziehung gesetzt wer- den konnten. (3bereinstimmend tar beide Sauren ergab sich folgende Reihenfolge: Aeeton (0,25 T), Dioxan (0,27 T), Isobutanol (0,55 T), n-Butanol (0,68 T), Isopropanol (0,7 T), Butanon (0,73 T), Propanol (0,75 T), )~thanol (0,85 T) Methanol (fast 1), verd. Ammoniak (1). Die danach zu- sammenstellbaren Kombinationen werden durch das Tai- ling stark eingeschr~nkt. Scharf umrissene runde Flecke bei guter Trennung gab die Mischung: n-Butanol-Wasser- 30 %ige w/it~rige MethylaminlOsung ( 80 : 6 : 15) in allen vier untersuchten Schichten (vgl. Fig. 3).

Die Polyacryls~ureamidschichten lassen also zum ersten Mal eine Trennung von Benzol- und Toluolsulfons~iure zu. Sie trennen auch Benzolsulfonsiiure von o-Benzoldisulfon- s~ure, was an dem System yon Endres, Grassmann und Oppelt [6] nicht gelungen war [7]. Bemerkenswert ist die Umstellung in der Reihenfolge von o-BenzoldisulfonsAure gegentiber den beiden Isomeren an Nylon 66. Sic entspricht den Erfahrungen, die Grassmann u.a. [8] bei o-Diphenolen gemacht haben. Die Polyacrylamidschichten kennen diese Ausnahme nicht, und auch am Polyacrylnitril tritt sie nicht auf. Die dichte Aufeinanderfolge der bindenden Gruppen in den neuen Sorptionsmitteln gibt auch der o-S~ure die M6glichkeit, dafS beide Siiuregruppen mit zwei benachbar- ten Acceptorgruppen normale Wasserstoffbindungen ein- gehen k6nnen. PAN ist wieder das wenigst aktive Sorptions- mittel, die anderen folgen in der Reihe Polyacryls/iureamid < Nylon < Acetylpolyacryls~ureamid, wenn man die Mono- sulfons~uren zugrundelegt. Gegenuber zweibasischen S/iuren ist Polyacrylsaureamid das aktivste der 4 Sorbentien.

4. Kohlehydrate Infolge ihrer iJberwiegenden Ringstruktur soUten die Zucker se~ stereospezifisch gebunden werden, denn die Bildung yon Wasserstoffbindungen an einer Acceptoroberfliiche mufS yon der Zug'~inglichkeit det Hydroxylgmppen auf einer Seite des Rings abh~ngen.

Als Vorbereitung far die Fliet~mittelauswahl wurden zu- n~ichst an einer Polyacryls~ureamid-Schicht die Rf-Werte ftir Arabinose und Xylose mit reinen Losungsmitteln be- sthnmt. Sie lautet (geordnet nach zunehmenden Rf-Werten): Methylacetat,'Aceton, Isopropanol, Methylathylketon, n- Butanol, Dioxan, n-Propanol, Athanol, Methanol, Wasser. Sie stimmt in beiden F~illen ann~hernd i~berein und ~hnelt der Anordnung gegentiber oxydischen Adsorbentien nach Trappe [9]. Auffallend ist die geringe Elutionswirkung yon Isopropanol und die verh~ltnism~t~ig hohe von Dioxan. Letztere k6nnte damit erld~irt werden, daf~ Dioxan zwei starke Acceptorgruppen enth~lt, die einen mit cis-axial- st~indigen Hydroxylen der Zucker vergleichbaren Abstand

haben. Es kOnnte geeignete Zucker in der LOsung komple- xieren und dadurch die Verftigbarkeit ihrer Donatorgruppen gegeniJber der sorbierenden Oberflhche mindern. Es ist be- kannt, daft manche Glycoside recht feste Aceton-Losungs- mittelverbindungen eingehen. Von einem acetonhaltigen Fliet~mittel wird man besondere Spezifit~ten erwarten dtirfen.

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Fig. 3 Rf values of benzene monosulphonic acids on polyacrylonitrile (A), Nylon 66 (B), polyacrylic acid amide (C), and N-acetyl- polyactylic acid amide (D) with n-butanokwater-methylamine (30 % in water) 80 : 6 : 15. B = benzene monosulphonic acid, T = p-toluene monosulphonic acid, oB = o-benzene disulphonic acid, mB= m-benzene disulphonic acid, pB = p-benzene disulphonic acid.

Rf-Werte yon Benzolsulfons~iuren an Polyacrylnitril (A), Nylon 66 (B), Polyacryls~iureamid (C) und N-Acetyl-Polyacrylsaureamid (D) mit n-Butanol-Wasser-Methylamin (30 %ig in Wasser) 80:6 : 15. B = Benzolsulfons~ure, T = p-Toluolsulfons.~iure, oB = o-Benzol- disulfons~iure, mB -- m-Benzoldisulfons~ure, pB = p-Benzoldisul- fon~ure.

Valeurs Rf d'acides benzine monosulfoniques sur polyacryP nitrile (A), Nylon 66 (B), amide d'acide polyacrylique (C), et amide d'acide N-ac~tyl-polyacrylique (D) avec N-butanol-eau- m~thylamine (30 % en solution aqueuse) 80 : 6 : 15. B = benzine sulfon~, T = p-toluene sull"on~, oB = acide o-benzlne bisulfoni- que, mB = acide m-benzlne bisulfonique, pB = acide p-benzlne bisulfonique.

Chromatographia 1, 1968 Original 305

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0.3

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xy xy

50

So A~ Fig. 4 At" ~t Rf values of sugaxs on Nylon 66 (A), polyacrylic acid amide (B), La GI. L~, and N-acetyl-polyacrylic acid amide (C) with 90 ml methyl ace- Ga ta te and 2.5 (I), 5 (II), 7.5 (III), and 10 (IV) ml water.

Ga Xy = xylose, So = sol'bose, Ar = arabinose, GI = glucose, L~i = i i r levulose, Ga = galactose, La = lactose.

Rf-Werte von Zuckern an Nylon 66 (A), Polyaeryls~ureamid (B) und N-Acetyl-Polyacryls~ureamid (C) mit 90 ml Essigs~iuremethyl- ester und 2,5 (I), 5 (II), 7,5 (III) und 10 (IV) mlWasser.

La Xy = Xylose, So = Sorbose, Ar = Arabinose, GI = Glucose, L~i = La L~ivulose, Ga = Galactose, La = Lactose.

Valeurs Rf de sucres sur Nylon 66 (A), acide d 'amide polyacry- lique (B) et amide d'acide N-ac~tyl-polyacrylique (C) avec 90 cm 3 d'ac~tate de m~thyle et 2,5 (I), 5 (II), 7,5 (1II) et 10 (IV) cm 3 d'eau. Xy = Xylose, So = Sorbose, Ar = Arabinose, GI = Glucose, Lii = L~vulose, Ga = Galactose, La = Lactose.

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Ga Fig. S

Rf values of sugars on polyacrylonitrile (A), Nylon 66 (B), polyacrylic acid amide (C), and N-acetyl- polyacrylic acid amide (D) with 90 ml acetone and 2.5 (I), 5 (II), 7.5 (III), 10 (IV), and 15 0g) ml

La water. For the abbreviations, see Fig. 4~

Rf-Werte yon Zuckern an Polyacrylnitri l (A), Nylon 66 (B), Polyacrylsaureamid (C) und N-Ace- t y l -Po lyac ry l s~ eamid (D) mit 90 ml Aceton und 2,5 (I), 5 (II), 7,5 (III), 10 (IV) und 15 (V) ml Wasser. Erkl~rung der Abkiirzungen siehe Fig. 4.

Valeurs Rf de sucres sur polyaery].nitrile (A), Nylon 66 (B), amide d 'acide polyacrylique (C) et amide d 'acide N-ac~tyl-polyacrylique (D) avec 90 cm a d 'ac~tone et 2,5 (I), 5 (II), 7,5 (III), 10 (IV) et 15 (V) cm 3 d'eau.

t . . Pottt les abbrewatlons, voir Fig. 4.

3 0 6 Chromatographia 1, 1968 Original

Das starke Tailing, das mit den reinen Fliegmitteln beob- achtet wird, liil~t sich in allen F/illen durch Zusatz von Wasser oder Dimethylforrnamid beheben. Dadurch werden nattirlich die Rf-Werte gr6ger. Das Grundl6sungsmittel mug daher bei den Monosacchariden aus der ersten H~ilfte der L6sungsmittelreihe genommen werden. Es wurden 4 Kombi- nationen erprobt, die sich er~nzen und eine optimale An- passung an das jeweilige Trennproblem erlauben.

a) Methylacetat-Wasser Zu 90 ml Methylacetat wurden 2,5 (I), 5 (II), 7,5 (III) und 10 (IV) ml Wasser zugeftigt. Die Rf-Werte yon 7 Zuckem zeigt Fig. 4.

Die Aktivit~itsreihe ist hier wieder anders. PAN ist das schwgchste Sorbens und f ttr Trennungen nicht brauchbar. Dann folgt Polyacryl~ureamid und in geringem Abstand N-Acetyl-Polyaeryls/iureamid. Die s~rkste Sorption aus dem Gemisch I finder an Nylon 66 start. Mit steigendem Wasser- gehalt nimmt sie aber rascher ab als bei den beiden Amiden und steht dann etwa zwischen ihnen. Die Reihenfolge tler Zucker ist keineswegs konstant. Die Trennungen sind im allgemeinen gut. Wegen der leichten Verseifbarkeit des Methylacetats mug das Fliet~mittel jedesmal frisch ange- setzt werden.

b) Aceton - W a s s e r

Gemische aus 90 ml Aceton und 2,5 (1), 5 (ii), 7,5 (III) 10 (IV) und 15 ml (V) Wasser geben vor aUem an den S~iureamidschichten gut ausgewogene Trennungen, die je nach dem Wassergehalt auf sctmeller oder langsamer laufende Zucker ausgedehnt werden k6nnen. Die Rf- Werte sind in Fig. 5 mitgeteilt.

Mindestens 2,5 % Wasser sind n6tig, um den Monosaceha- riden die ausreichende L6slichkeit in Aceton zu geben und damit das Tailing zu vermeiden. In diesem Gemisch I ge- lingt auch die Trennung an PAN, wobei allerdings Glucose und Lavulose zusammenfallen. Mit allen wasserreicheren Gemischen erhiilt man an diesem schwachen Sorptions, mittel die meisten oder aUe Zucker (auch Laktose) dicht unter der Front nach Art einer Verdr~ingungsanalyse zu- sammengeschoben. Die drei anderen Sorptionsmittel lassen sich nicht mehr in eine eindeutige Reihenfolge der Aktivi- t~t anordnen, da sie yon Zucker zu Zucker verschieden ist. Der durchschnittliche Anstieg der Rr-Werte beim Obergang Yon Gemisch I zu 1II ist bei Polyacrylsiiureamid 0,12, bei den beiden anderen 0,26. Daher ~indert sich die Aktivitfits- reihe je nach dem Fliel~mittel. Gute Trennungen der Zucker erh~ilt man an Polyacryls~ureamid und an N-Acetyl-Poly- aerylsaureamid mit Aceton, das maximal 5 % Wasser enthalt.

e) Butanon-Wasser Die Bezifferung der Gemische mit 2,5 (I), 5 (II), 7,5 (III), 10 (IV) und 15 (V) ml Wasser auf 90 ml Butanon wurde Wie beim Aceton gew~ihlt, um den Vergleich zu erleichtern.

Bei diesem hpophileren Grundlosungsmittel sind aber min- destens 8 % Wasser n6tig, um definierte Flecke zu erhalten; die Gemische I und II erscheinen daher in Fig. 6 nicht.

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Fig. 6 Rf values of sugars on Nylon 66 (A), polyacrylic acid amide (B), and N-acetyl-polyacrylic acid amide (C) with 90 ml butanone and 7.5 (liD, 10 (IV), and 15 (V) ml water. For the abbreviations, see Fig. 4.

Rf-Werte yon Zuckern an Nylon 66 (A), Polyacryls/iureamid (B) und N-Acetyl-Polyacryls~ureamid (C) mit 90 ml Butanon und 7,5 fill), 10 (IV) und 15 (V) mlWasser. Erkla.rung der Abktirzungen siehe Fig. 4.

Valeurs Rf de sucres sur Nylon 66 (A), amide d'acide polyacry- I - 3 lique (B) et amide d'acide N-acetyl-polyacrylique (C) avec 90 cm

de butanone et 7,5 (III), 10 (IV), et 15 (V) cm d'eau. t . . Pour les abbrewahons, votr Fig. 4.

Dieses Trennsystem ~ihnelt sehr stark dem vorher beschrie- benen mit Aceton als Laufirdttelkomponente. Dies sttitzt unsere Auffassung, dag die Retention der Zucker w~ihrend des Trennvorgangs ganz tiberwiegend durch Wasserstoff- bindungen erfolgt. W~iren Verteilungsvorg/inge wesentlich beteiligt, so sollten sie sich bei dtesem hydrohoberen Grund- 16sungsmittel wesentlich st~irker bemerkbar machen als beim Aeeton. Die Rf-Werte liegen im Durchschnitt dichter bei- sanmlen als im Aceton-System, wodurch die Trennung schlechter wird. Augerdem sind die Flecke in der Regel

Chromatographia 1, 1968 Original 307

oval, nicht rund. Wird dies durch noch h6heren Wasserzu- satz behoben, dann h~ufen sich die Substanzen im oberen Teil des Chromatogramms. Zur analytischen Verwendung ist dieses System nieht zu empfehlen.

d) Dioxan-Wasser Trotz der schlechten Eigenschaft des reinen Dioxans als Laufmittel lassen sich damit noch Trennsysteme aufbauen, wenn man sich auf einen geringen Wasserzusatz beschr~tnkt (Fig. 7).

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F~g. 7 Rf values of sugars on polyaerylic acid amide (A) and N-acetyl- polyacrylic acid amide (B) with dioxane-water (2.5 %). For the abbreviations, see Fig. 4.

Rf-Werte yon Zuckern an Polyacryls~iureamid (A) und N-Acetyl- Polyacryl~ureamid (B) mit Dioxan-Wasser (2,5 %). Erkl~rung der Abkiirzungen siehe Fig. 4.

Valeurs Rf de sucres sut amide d'acide polyacrylique (A) et amide + �9 p , d actdeN-acetyl-polyacrylique (B) avec 2,5 % de dioxane dans de

l'eau. t , . Pour les abbreviations, votr Fig. 4.

Das System konnte, eventuell mit einem hoheren Wasser- zusatz, zur Trennung yon Biosen und yon Triosen sowie bei Glycosiden geeignet sein.

Diskussion der Ergebnisse

Von Grassmann und Mitarbeitern [ 1,2] stammt die Auf- fassung, daf~ die Chromatographie an Polyamiden minde- stens tiberwiegend auf der Ausbildung von Wasserstoff- br0cken beruht. Dieser Meinung schlieSen wir uns an. In einer neueren Arbeit [ 10] wird einem Gel aus dem Poly- amid und einer alkoholischen Komponente des FlieSmit- tels die Rolle der stationaren Phase zugeschrieben. Soweit wir alkoholhaltige Flief~mittel verwendet haben, spricht nichts ftir eine solche Verteilungschromatographie unter Phasenurnkehr. Bei den Aminosiiuren und Dicarbons~iuren sind es gerade die Stoffe mit grot~em paraffinischem An- tell, die hohe Rf-Werte haben, also nur wenig verz6gert werden. Benzolsulfons~ture und Toluolsulfons~ure lassen sich an einer Nylon-Schicht nicht trennen, obwohl sie sich in ihrer Hydrophilie stark unterscheiden. Die schliet~lich erreichte Trennung an den neuen Amidschichten verlauft so, dat~ die lipophilere Toluolsulfons~ure welter wandert, also nicht im Sinne einer Phasenumkehr. Die starke PH- Abh~ngigkeit bei allen diesen S~uren l~iSt sich durch eine Bindung fiber Wasserstoffbriicken mindestens so gut er- kl~ren wie aus LOslichkeitsbetrachtungen. Bei den Kohle- hydraten haben sich alkoholhaltige Fliel~mittel nicht be- w~ihrt; Ester, Ketone und Ather, die den Gmndstock der Gemische bilden, dtirften in Konkurrenz mit dem ebenfalls vorhandenen Wasser kaum eine Gelphase aufbauen, lhre funktionellen Gruppen enthalten alle Sauerstoffatome, die gute Acceptoren for Wasserstoffbrticken sind. Schlie~ lich spricht das stets gleichartige Verhalten von nicht acety- liertem und acetyliertem Polyamidgel gegen eine wesent- liche Beteiligung yon Verteilungserscheinungen. Die durch- weg beobachtete Zunahme der Rf-Werte mit steigendem Wassergehalt der Fliet~mittel erkl~irt sich aus der Konkur- renz zwischen Wasser und den Analysensubstanzen um die Acceptorgruppen der Tr~germaterialien.

Bei den Kohlehydraten fallt besonders (let h~ufige Wechsel in der Reihenfolge im Chromatogramm auf. Dabei diirfte eine Verschiebung der Gleichgewichtslage zwischen Carbo- nylform, a- und/~-Form, eventuell auch Furanose und Pyra- nosestruktur durch die wechselnde Zusammensetzung der Fliet~mittel eine Rolle spielen. In der analytischen Praxis ergibt sich daraus eine grot~e Anpassungsf~ihigkeit an das jeweils vorliegende Trennproblem.

Beschreibung der Versuche

Polyacrylsiiureamid [4] 60 g Polyacrylnitril (PAN der Farbenfabriken Bayer, Leverkusen) der Korngr6t~e 0,076 mm werden mit so viel yon insgesamt 300 ml 30 % Hydroperoxid versetzt, dat~ eine eben rtihrbare Suspension entsteht. Diese wird mit 6 n Natronlauge lackmusalkalisch gemacht und bei 60 ~ kriiftig geriJhrt. Nach zwei und vier Stunden wird der Rest des Oxydationsmittels je zur H~ilfte zugegeben. Durch Nachgeben yon Natronlauge wird standig alkalisch gehalten. Wenn Ammoniakgemch auftritt, ist die Tempe- ratur zu hoch. Nach 6 Stunden ist die Verseifung beendet.

308 Chromatographia 1, 1968 Original

Man kiihlt ab, neutralisiert mit verdtinnter Schwefels~ure und saugt ab. Dutch mehrfaches Aufschl~mmen und Nach- waschen mit Wasser entfernt man Salze und den Rest des Hydroperoxids; die Probe mit Titanylsulfat muff negativ sein. Man trocknet auf Tontellern 12 Stdn. an der Luft oder 4 Stdn. bei 50 ~ im Trockenschrank, zerdrtickt die ent- stehenden Brocken mit einem Pistill und siebt schliet~lich dureh ein Prtif'sieb der Maschenweite 0,076 mm.

N-Acetylpolyaeryls~ureamid [ 11 ] 50 g des getrockneten Polyacryls~iurearnids werden in einem Gemisch aus 200 ml Dimethylformamid, 20 ml Pyridin und 10 ml Acetanhydrid suspendiert und 2 Tage lang in einer verschlossenen Flasche geschiittelt. Die Suspen- sion farbt sich hellbraun. Der Bodenk6rper wird abzentri- fugiert, zweimal mit verdtmnter Essigs~ure, mehrfach mit Wasser und zum SchlufS mit )~thanol ausgewaschen. Trock- hen und Sieben wie oben.

Beschichten der Platten Die Glasplatten (20 x 20 cm) werden mit Vim vorgereinigt, dann 12 Stdn. in Chromschwefels~ure gestellt und mit Was- ser abgesptilt. Anschliel~en d wurde im Trockenschrank ge- trocknet. Ftir 5 Platten werden 8 g PAN, Polyacryls~iure- amid oder Acetylpolyacryl~ureamid in einer Schlifftlasche mit dem Gemisch aus 20 ml Chloroform und 30 ral ~thanol 2 Minuten lang durchgeschfittelt. Dann lfit~t man zur VoU- endung der Quellung mindestens 5 Minuten stehen, schiit- telt kurz um und ftillt in das Streichger~t. 5 g Polyamid (Woelm) werden in 45 ml )tthanol suspendiert ausgestrichen. Alle Platten wurden 12 Stdn. an der Luft getrocknet. Die Analysen wurden stets aufsteigend mit Kammers~ttigung durchgeftihrt und dauern 1/2 bis 3 Stdn., je nach dem Fliet~mittel.

Amino~uren wurden mit folgenden Reagenzl6sungen sichtbar gemacht: 1) 0,3 g Ninhydrin in 100 ml n-Butanol mit 3 ml Eisessig [12, 13]. 2) Man mischt kurz vor Gebrauch gleiche Mengen folgender Vorratsl6sungen [ 12, 13]: I. 50 ml 0,2 % Ninhydrinl6sung in abs. Athanol, 10 ml Eisessig, 2 ml 2, 4, 6-Collidin; II. 1% L6sung von Cu (NO3)2 �9 3 H20 in abs. ~,thanol. Die besprfihte Platte wird in beiden Fiillen auf 120 ~ im Troekenschrank er- hitzt. 1) gibt einheitlich rotviolette Flecke, bei 2) treten individuelle Farbungen auf.

Reduzierende Zueker [12, 13] 0,93 g Anilin und 1,66 g o-Phthals~ure werden in 100 ml wasserges~ttigtem n-Butanol gel6st. Die besprtihten Platten werden auf 115- 120 ~ im Trockenschrank erhitzt. Dunkel- braune Flecke auf leicht get6ntem Grund, die im UV-Licht fluorescieren.

Dicarbonsiiuren und Sulfonsiiuren 0,04 g Bromkresolpurpur werden in 1 O0 ml 50 % )ithanol gel6st und auf PH 10 eingestellt. [ 15]. Sofort nach dem Besprtthen zeichnen sich die S~iuren als gelbe Flecke auf leuchtend blauem Grund ab.

Literatur

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Received March 22, 1968 Accepted March 24, 1968

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