PProtéines de Stress : marqueurs rotéines de Stress : marqueurs de protéotoxicitéde protéotoxicité

Qu’est ce que les Hsp ?Qu’est ce que les Hsp ?Qu’est ce que les Hsp ?Qu’est ce que les Hsp ?

Hsp : Heat Shock ProteinsHsp : Heat Shock Proteins Hsp : Heat Shock ProteinsHsp : Heat Shock Proteins

Hsp 70Hsp 70 Hsp 70Hsp 70 Hsp 90Hsp 90 Hsp 90Hsp 90 Hsp 100Hsp 100 Hsp 100Hsp 100

Classées en plusieurs famillesClassées en plusieurs familles Classées en plusieurs famillesClassées en plusieurs familles

Hsp de faible PMHsp de faible PM Hsp de faible PMHsp de faible PM Hsp 60Hsp 60 Hsp 60Hsp 60

Ritossa, 1962 : Choc thermiqueRitossa, 1962 : Choc thermique Ritossa, 1962 : Choc thermiqueRitossa, 1962 : Choc thermique

Hsp 70 : hautement conservéesHsp 70 : hautement conservées Hsp 70 : hautement conservéesHsp 70 : hautement conservées

Hsp constitutivesHsp constitutives Hsp constitutivesHsp constitutives

Transport sub-cellulaire des protéinesTransport sub-cellulaire des protéines Transport sub-cellulaire des protéinesTransport sub-cellulaire des protéines

Repliment des protéines nativesRepliment des protéines natives Repliment des protéines nativesRepliment des protéines natives

Réparation des protéines dénaturéesRéparation des protéines dénaturées Réparation des protéines dénaturéesRéparation des protéines dénaturées

Dégradation des protéines non réparéesDégradation des protéines non réparées Dégradation des protéines non réparéesDégradation des protéines non réparées

Chaperons moléculairesChaperons moléculaires Chaperons moléculairesChaperons moléculaires

Hsp inductiblesHsp inductibles Hsp inductiblesHsp inductibles

Tous les systèmes vivantsTous les systèmes vivants Tous les systèmes vivantsTous les systèmes vivants

Plusieurs agents inducteursPlusieurs agents inducteurs Plusieurs agents inducteursPlusieurs agents inducteurs

Bactérie, Levure, Organismes supérieursBactérie, Levure, Organismes supérieurs Bactérie, Levure, Organismes supérieursBactérie, Levure, Organismes supérieurs

Fièvre, Infection virale, …. Fièvre, Infection virale, …. Fièvre, Infection virale, …. Fièvre, Infection virale, ….

Stress oxydatif Stress oxydatif Stress oxydatif Stress oxydatif

Métauds lourds Métauds lourds Métauds lourds Métauds lourds

Xénobiotiques Xénobiotiques Xénobiotiques Xénobiotiques

CytoprotectionCytoprotection CytoprotectionCytoprotection

Différents facteurs d’induction des familles Différents facteurs d’induction des familles de Hspde Hsp

Hsp110

Hsp90Hsp70Hsp60

Hsp27

Agents de stress (dénaturation protéique):

Altération de l’état physiologique(augmentation de la synthèse protéique):

- Choc thermique- Alcool- Rayons ultraviolets- Métaux lourds - Oxydants- Chimiothérapie

- Cycle cellulaire- Facteurs de croissance- Infection, inflammation - Récupération à hypoxie ou carence en glucose

Les protéines de choc thermique se lient à des protéines Les protéines de choc thermique se lient à des protéines

dégradées par un stress et évitent leur agrégation et dégradées par un stress et évitent leur agrégation et

rétablissent leur fonctionsrétablissent leur fonctions

Les protéines de choc thermique se lient à des protéines Les protéines de choc thermique se lient à des protéines

dégradées par un stress et évitent leur agrégation et dégradées par un stress et évitent leur agrégation et

rétablissent leur fonctionsrétablissent leur fonctions

Mécanismes d’induction : protétoxicitéMécanismes d’induction : protétoxicité Mécanismes d’induction : protétoxicitéMécanismes d’induction : protétoxicité

Hsp 70: Marqueurs de toxicité universels non spécifiquesHsp 70: Marqueurs de toxicité universels non spécifiquesHsp 70: Marqueurs de toxicité universels non spécifiquesHsp 70: Marqueurs de toxicité universels non spécifiques

L’induction des Hsp : L’induction des Hsp : L’induction des Hsp : L’induction des Hsp :

réponse sensible et précoceréponse sensible et précoce

réponse dose et temps dépendanteréponse dose et temps dépendante

réponse sensible et précoceréponse sensible et précoce

réponse dose et temps dépendanteréponse dose et temps dépendante

Hsp et Toxicologie Hsp et Toxicologie moléculairemoléculaire

Quels rôles jouent les Hsp ?

1) Assiste le repliment des protéines dans différents Assiste le repliment des protéines dans différents

compartiments cellulairescompartiments cellulaires

2)2) Assure le maintien des structures tri-dimentionnelles Assure le maintien des structures tri-dimentionnelles

des protéinesdes protéines, ,

3)3) Asssite le repliement correcte des protéines dénaturéesAsssite le repliement correcte des protéines dénaturées

4)4) Assure la Assure la translocation translocation des protéines à travers les des protéines à travers les

differents compartiment cellulairesdifferents compartiment cellulaires, ,

5)5) Pr Préévviient ent de l’aggrégation des protéinesde l’aggrégation des protéines

6)6) D Déégradgradee des protéines instablesdes protéines instables

HSP FamilyCellular Location

Proposed Function

HSP27 (sHSP)

Cytosol, nucleus

Microfilament stabilization, antiapoptotic

HSP60 Mitochondria

Refolds proteins and prevents aggregation of denatured proteins, proapoptotic

HSP70 family:

Antiapoptotic

  HSP72 (Hsp70)

Cytosol, nucleus

Protein folding, cytoprotection

  HSP73 (Hsc70)

Cytosol, nucleus

Molecular chaperones

  HSP75 (mHSP70)

Mitochondria

Molecular chaperones

  HSP78 (GRP78)

ER Cytoprotection, molecular chaperones

HSP90 Cytosol, ER, nucleus

Regulation of steroid hormone receptors, protein translocation

HSP110/104 Cytosol Protein folding

Table  1.   Cellular locations and proposed functions of mammalian heat shock protein familiesHSP, heat shock protein; sHSP, small HSP; ER,

endoplasmic reticulum.

La famille des Hsp 70

HSP70 HSP70 sont les plus inductibles et les sont les plus inductibles et les

plus conservéesplus conservées

Elles présententElles présentent 60-80% 60-80% d’homologie d’homologie

dans le monde des eucaryotesdans le monde des eucaryotes

Mécanisme d’induction des Hsp

70

La zéaralénone induit-elle La zéaralénone induit-elle

l’expression des Hsp 70 ?l’expression des Hsp 70 ?

Provoque-t-elle une protéo-toxicité ?Provoque-t-elle une protéo-toxicité ?

La zéaralénone induit-elle La zéaralénone induit-elle

l’expression des Hsp 70 ?l’expression des Hsp 70 ?

Provoque-t-elle une protéo-toxicité ?Provoque-t-elle une protéo-toxicité ?

LLaboratoire de aboratoire de RRecherche sur les echerche sur les SSubstances ubstances BBiologiquement iologiquement CCompatibles (ompatibles (LLRRSSBBCC))

ObjectifsObjectifsObjectifsObjectifs

Étudier la cytotoxicité de la ZENÉtudier la cytotoxicité de la ZEN

Étudier l’expression des Hsp 70 et leur potentiel Étudier l’expression des Hsp 70 et leur potentiel

cytoprotecteurcytoprotecteur

Modèle in vitro : Hep Modèle in vitro : Hep G2G2Modèle in vitro : Hep Modèle in vitro : Hep G2G2

Le foie est une cible préférentielle Le foie est une cible préférentielle de la ZEN de la ZEN

Le foie est une cible préférentielle Le foie est une cible préférentielle de la ZEN de la ZEN

Activation métabolique (Activation métabolique (-, -, --zearalenol)zearalenol)

Activation métabolique (Activation métabolique (-, -, --zearalenol)zearalenol)

Modèle retenu pour la réponse Modèle retenu pour la réponse HspHsp

Modèle retenu pour la réponse Modèle retenu pour la réponse HspHsp Hépatocytes humainsHépatocytes humains Hépatocytes humainsHépatocytes humains

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

ZEN concentration (µM)

Via

bi l

ité

(% d

u c

on

tro

l)

Inhibition dose dépendante de la viabilité CI50 = 95 µMInhibition dose dépendante de la viabilité CI50 = 95 µM Inhibition dose dépendante de la viabilité CI50 = 95 µMInhibition dose dépendante de la viabilité CI50 = 95 µM

Cas de la ZEN / Hep G2Cas de la ZEN / Hep G2Cas de la ZEN / Hep G2Cas de la ZEN / Hep G2

Viabilité cellulaireViabilité cellulaire Viabilité cellulaireViabilité cellulaire

Comment peut-on déterminer le niveau Comment peut-on déterminer le niveau

d’expression d’une protéine bien déterminée d’expression d’une protéine bien déterminée

au niveau d’une population cellulaire ou à au niveau d’une population cellulaire ou à

partir d’un tissu ou organe ?partir d’un tissu ou organe ?

Comment peut-on déterminer le niveau Comment peut-on déterminer le niveau

d’expression d’une protéine bien déterminée d’expression d’une protéine bien déterminée

au niveau d’une population cellulaire ou à au niveau d’une population cellulaire ou à

partir d’un tissu ou organe ?partir d’un tissu ou organe ?

DémarcheDémarcheDémarcheDémarche

Traitement des cellules avec des concentrations croissantes Traitement des cellules avec des concentrations croissantes

de ZENde ZEN

Extraction des protéines cellulairesExtraction des protéines cellulaires

Séparation des protéines par électrophorèseSéparation des protéines par électrophorèse

Transfert des protéines Transfert des protéines

Immunodétection de la protéine d’intérêtImmunodétection de la protéine d’intérêt

1.1. Sites inoccupés par les protéines transférées bloqués Sites inoccupés par les protéines transférées bloqués

2.2. Anticorps monoclonal anti-Hsp 70 de souris Anticorps monoclonal anti-Hsp 70 de souris

3.3. Anticorps anti-IgG de souris couplé à la phosphatase alcaline Anticorps anti-IgG de souris couplé à la phosphatase alcaline

4.4. Phosphatase alcaline Phosphatase alcaline

5.5. S. Substrats révélateurs de l’activité phosphatase alcaline NBT/ BCIP S. Substrats révélateurs de l’activité phosphatase alcaline NBT/ BCIP

P. Précipité coloré, produit de la réaction catalysée par la phosphatase P. Précipité coloré, produit de la réaction catalysée par la phosphatase

alcaline en présence de NBT, BCIP sur le site du complexe antigène alcaline en présence de NBT, BCIP sur le site du complexe antigène

anticorpsanticorps

1.1. Sites inoccupés par les protéines transférées bloqués Sites inoccupés par les protéines transférées bloqués

2.2. Anticorps monoclonal anti-Hsp 70 de souris Anticorps monoclonal anti-Hsp 70 de souris

3.3. Anticorps anti-IgG de souris couplé à la phosphatase alcaline Anticorps anti-IgG de souris couplé à la phosphatase alcaline

4.4. Phosphatase alcaline Phosphatase alcaline

5.5. S. Substrats révélateurs de l’activité phosphatase alcaline NBT/ BCIP S. Substrats révélateurs de l’activité phosphatase alcaline NBT/ BCIP

P. Précipité coloré, produit de la réaction catalysée par la phosphatase P. Précipité coloré, produit de la réaction catalysée par la phosphatase

alcaline en présence de NBT, BCIP sur le site du complexe antigène alcaline en présence de NBT, BCIP sur le site du complexe antigène

anticorpsanticorps

RésultatsRésultatsRésultatsRésultats

6h6h6h6h

12h12h12h12h

24h24h24h24h

Expression des Hsp 70Expression des Hsp 70 Expression des Hsp 70Expression des Hsp 70

C 10 20 40 80 100 µM

C 10 20 30 40 50 nM

Choc thermiqueChoc thermique Choc thermiqueChoc thermique 0 4 8 12 16 20h

C 10 20 40 µM

ZEN : 120 µMZEN : 120 µM ZEN : 120 µMZEN : 120 µM

CTN : 260 µMCTN : 260 µM CTN : 260 µMCTN : 260 µM

T-2 toxine : 110 nMT-2 toxine : 110 nM T-2 toxine : 110 nMT-2 toxine : 110 nM

La ZEN, CTN et T-2 toxine sont cytotoxiques et La ZEN, CTN et T-2 toxine sont cytotoxiques et

induisent l’expression des Hsp 70 d’une manière induisent l’expression des Hsp 70 d’une manière

dose dépendantedose dépendante

La ZEN, CTN et T-2 toxine sont cytotoxiques et La ZEN, CTN et T-2 toxine sont cytotoxiques et

induisent l’expression des Hsp 70 d’une manière induisent l’expression des Hsp 70 d’une manière

dose dépendantedose dépendante

Cas de l’OTA : Hep G2 /VeroCas de l’OTA : Hep G2 /VeroCas de l’OTA : Hep G2 /VeroCas de l’OTA : Hep G2 /Vero

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60 80 100 120 140 160

OTA concentrations (µM)

Hep G2 cells

Vero cells

Viability (% of control)

OTA : cytotoxique pour les Hep G2 et les Vero (CI 50: 90 et OTA : cytotoxique pour les Hep G2 et les Vero (CI 50: 90 et

120 µM)120 µM)

OTA : cytotoxique pour les Hep G2 et les Vero (CI 50: 90 et OTA : cytotoxique pour les Hep G2 et les Vero (CI 50: 90 et

120 µM)120 µM)

OTA et expression des Hsp 70OTA et expression des Hsp 70OTA et expression des Hsp 70OTA et expression des Hsp 70