Proposition d'un protocole d'analyses microbiologiques de
substrats thermaux utiliss dans le cadre d'application cutane
Rdig dans le cadre du projet de recherche en collaboration entre
AFRETH (Association Francaise pour la REcherche Thermale) Les
tablissements thermaux de Balaruc-les-bains l'Universit Paul
Sabatier, ToulouseIII(Laboratoire de microbiologie industrielle,
UFR des Sciences Pharmaceutiques)
Christel PIGASSE Responsable d'Etude Universit Paul Sabatier,
UFR des Sciences Pharmaceutiques Laboratoire de microbiologie
industrielle 35 chemin des marachers 31062 Toulouse cedex9
Sommaire : Introduction 1. 2. 3. 4. Domaine dapplication
Rfrences normatives/support pour l'tude et la constitution de ce
protocole Points valus au cours de cette tude Termes et dfinitions
3.1 Dfinitions 3.2 Micro-organismes d'intrt: 5. Principe 6.
Appareillage et matriel spcifique 7. Milieux de culture 7.1.
Gnralits 7.2. Milieu de culture 8. Mode opratoire 8.1. Prparation
de l'chantillon 8.2. Ensemencement/ Mthode de
dnombrement/Incubation sur milieu prsomptif 8.3. Lecture 8.4.
Dtection et identification des germes indicateurs 8.5. Milieux
confirmatifs et Lecture 9. Expression de rsultats/ Mode de calcul
10. Rfrences bibliographiques 11. Annexes Annexe 1:Composition des
milieux de culture Annexe 2: Recommandations/circulaires sur l'eau
permettant d'tablir des seuils de dtection des flores dans les
substrats thermaux:
Proposition d'un protocole d'analyses bactriologiques de
substrats thermaux utiliss dans le cadre d'application cutane
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Sommaire : Introduction L'intrt de la conception de ce protocole
est de permettre l'tablissement thermal d'assurer la qualit de la
boue thermale initiale ainsi que de la boue thermale recycle. De
par le mode conception du plode de la station d'intrt, une phase de
recyclage du substrat ( hauteur d'environ 90%) au cours de la
saison d'exercice (mars novembre). Cette tape impose l'tablissement
d'un protocole d'analyse microbiologique rigoureux et refltant de
faon optimale l'tat sanitaire de la boue thermale. Cette dernire
tant applique au niveau cutane, une attention particulire sera
porte sur les micro-organismes potentiellement pathognes,
transmission interhumaine. 1. Domaine dapplication Le protocole
s'applique l'analyse microbiologique de la boue thermale, ainsi qu'
l'analyse de sdiments dont elle est constitue. L'eau thermale
entrant dans la composition de la boue thermale rpond une
rglementation, rpondant la circulaire relative la gestion du risque
microbien li l'eau minrale dans les tablissements thermaux. 2.
Rfrences normatives/support pour l'tude et la constitution de ce
protocole Cosmtique NF ISO 21148 : Cosmtiques Microbiologie -
Instructions gnrales pour les examens microbiologiques NF ISO 21149
: Cosmtiques Microbiologie Dnombrement et dtection des bactries
arobies msophiles NF ISO 21150 : Cosmtiques Microbiologie Dtection
dEscherichia coli ISO 22717:2006 : Cosmetics Microbiology Detection
of Pseudomonas aeruginosa NF ISO 22718: Cosmtiques Microbiologie
Dtection de Staphylococcus aureus Norme sur l'eau Circulaire DGS/VS
4 N 2000-336 du 19 juin 2000 relative la gestion du risque
microbien li l'eau minrale dans les tablissements thermaux EN ISO
12 780: Qualit de leau - Dtection et dnombrement de Pseudomonas
aeruginosa par filtration sur membrane. NF T 90-413: Essais des
eaux -Recherche et dnombrement des coliformes et des coliformes
thermotolrants- Mthode gnrale par ensemencement en milieu liquide
(NPP). NF T 90-414: Essais des eaux- Recherche et dnombrement des
coliformes et des coliformes thermotolrants- Mthode gnrale par
filtration sur membrane. NF T 90-420: Examens bactriologiques des
eaux destines la consommation humaine. NT T 90-415: Essais des
eaux- Recherche et dnombrement des spores de bactries anarobies
sulfito-rductrices et de Clostridium sulfito-rducteurs- Mthode
gnrale par incorporation en glose en tubes profonds. NF T 90-421:
Examens bactriologiques des eaux de piscines XP T 90-416: Essais
des eaux- Recherche et dnombrements de entrocoques- Mthode gnrale
par filtration sur membrane. NF EN ISO 5667-3: Qualit de l'eau-
Echantillonnage XP T 90-401: Essais des eaux- Dnombrement des
micro-organismes revivifiables 37C. XP T 90-402: Essais des eaux-
Dnombrement des micro-organismes revivifiables 22C.Proposition d'un
protocole d'analyses bactriologiques de substrats thermaux utiliss
dans le cadre d'application cutane
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3. Points valus au cours de cette tude: Les points ayant fait
l'objet d'une mise au point et d'une validation sont les suivants:
3.1 Dtermination de la vitesse d'agitation lors de l'chantillonnage
200 350 rpm 3.2 Dtermination des conditions optimales de
dnombrement des microflores arobie et aro-anarobie facultative
(37C): Milieux de culture (TS, R2A, PCA) Temps d'incubation (1-6j)
Technique d'ensemencement Etalement Inclusion 3.3 Evaluation de
limpact de la sdimentation sur le dnombrement des microflores
arobie et aro-anarobie facultative Boue thermale Sdiments 3.4 Essai
de dissociation des agrgats, impact sur le dnombrement total Agents
chimiques EDTA 0.01-0.5% Tween 3-20% Diluant Agents physiques
Broyage :2500-6500rpm, de 1 3min Ultrasons: Bain ultrasons ou
sonicateur, courant continu ou discontinu 3.5 Validation de la
slectivit de milieux pour des pathognes cutans en prsence de
substrats thermaux Choix de milieux slectifs de culture Technique
de dnombrement Etalement Filtration Interfrences des substrats sur:
Slectivit du milieu Croissance des pathognes Temps d'incubation
avant le dnombrement 4. Termes et dfinitions 4.1 Dfinitions
Sdiments lacunaires Les sdiments sont prlevs au niveau du bassin de
Thau et rsultent de l'rosion de la crote terrestre. Ils sont
constitus d'argile, limon, sable fin et matires humiques. Eau
thermale L'eau thermale entrant dans la constitution de la boue
thermale utilise pour l'tablissement de ce protocole est trs
minralise. Elle contient des oligo-lments et est riche en chlorure
et sodium (dans une moindre mesure en sulfate, calcium et
magnsium).Proposition d'un protocole d'analyses bactriologiques de
substrats thermaux utiliss dans le cadre d'application cutane
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Boue thermale (Balaruc-les-Bains): L'amalgame de sdiments
lacunaires et d'eau thermale ( hauteur d'environ 29% en eau)
constitue la boue thermale, substrat thermal reconnu pour ces
effets bnfiques en terme de rhumatologie. Microorganisme: Organisme
vivant monocellulaire dont la taille se situe dans le domaine du
microscopique. Pathogne: Un microorganisme est dit pathogne lorsque
qu'il engendre ou peut engendrer une pathologie ou maladie, et ce
de faon stricte ou opportuniste. Contamination inter-patient: La
boue thermale tant applique au niveau cutane, une contamination
entre patients via la boue est envisage du fait de l'tape de
recyclage. 4.2 Micro-organismes d'intrt: Afin d'assurer la qualit
"marchande" et "hygine" des produits, l'analyse inclut une
valuation quantitative globale ou spcifique sur la base d'une
slection d'indicateurs. D'un point de vue global, la caractrisation
de l'cosystme de substrat thermaux passe par le dnombrement des
flores viables et cultivables arobies, aro-anarobies facultatives
et anarobies stricts. Sur le plan spcifique, divers pathognes sont
recherchs. L'attention est porte sur les microorganismes
potentiellement pathognes au niveau cutan, en particulier
P.aeruginosa, S.aureus, les coliformes et les Clostridium
sulfito-rducteurs. L'importance de la recherche de ces
micro-organismes rside dans leur pathognie au niveau cutan et des
muqueuses (P.aeruginosa ou les coliformes). De plus, ils permettent
d'indiquer une contamination d'origine humaine (Clostridium
sulfito-rducteurs, coliformes) ou une dgradation de la qualit de la
boue thermale. 5. Principe L'analyse des substrats thermaux,
sdiments ou boues thermales, s'articule en 2 tapes. La premire
consiste en l'chantillonnage, passant par l'hydratation du
substrat, un vortexage de manire dissoudre les amas terreux, et
l'agitation de l'chantillon pour affiner la dissolution des
particules les plus grossires. L'analyse a proprement parl permet
une valuation de la population prsente au sein de l'chantillon.
Ainsi, les flores totales arobies ou anarobies, ou bien les flores
spcifiques peuvent faire l'objet de ces analyses. Pour se faire,
nous raliserons un chantillonnage poursuivi de dnombrements sur
milieu solide simple, ou bien spcifiques et slectifs selon le cas.
Suite une incubation dans un dlai suffisant, un dnombrement
permettra de quantifier et de caractriser l'chantillon. 6.
Appareillage et matriels spcifiques Agitateur mcanique permettant
de contrler la vitesse dagitation du plateau.
Proposition d'un protocole d'analyses bactriologiques de
substrats thermaux utiliss dans le cadre d'application cutane
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7. Milieux de culture 7.1. Gnralits Pour lanalyse de la flore
totale, le milieu de culture prconis est la glose Trypcase-soja
(composition Annexe 1). Ce milieu nutritif permet une croissance
des micro-organismes revivifiables et cultivables sans exercer de
pression de slection. La recherche des flores spcifiques passe par
lensemencement de l'chantillon sur 2 types de milieux. Le premier,
appel milieu prsomptif, va restreindre le dveloppement de certains
micro-organismes pour ainsi mettre en vidence la croissance du
micro-organisme recherch. La prsence dun germe donn est affirme
dans un second temps, sur milieu ou par test confirmatif
(compositions en Annexe 1). 7.2. Milieux de culture Trypcase-soja:
La base nutritive relativement riche de ce milieu convient la
culture d'un grand nombre de micro-organismes. Des milieux moins
nutritifs sont classiquement considrs pour ce type d'analyse.
Cependant, nos travaux ont dmontrs l'avantage du milieu
Trypcase-soja. Chapman: Le milieu de Chapman est un milieu slectif.
La culture sur ce milieu met en vidence uniquement les bactries qui
cultivent en milieu hypersal. En effet, sa forte concentration en
chlorure de sodium (75g.L-1) ralentit la croissance de la majorit
des bactries, l'exception des halophiles (organismes qui ont un
besoin et/ou rsistent de fortes concentrations en sel). Parmi ces
germes, on retrouve les bactries du genre Staphylococcus, mais
aussi les Micrococcus, les Enterococcus, les Bacillus, et de rares
bactries Gram ngatif. La croissance sur ce milieu permet d'tudier
la fermentation du mannitol par virage de lindicateur color, le
rouge de phnol, autour des colonies. Ainsi des colonies utilisant
le mannitol laisse suspecter l'appartenance du germe l'espce de S
.aureus. De par la charge saline de l'eau thermale, de nombreux
autres micro-organismes sont susceptibles de crotre sur ce milieu,
d'o la ncessit d'un test confirmatif. TTC Tergitol 7: Le milieu TTC
tergitol est un milieu slectif, utilis pour la recherche et le
dnombrement des coliformes. Sa slectivit est donne par la prsence
dheptadcylsulfate de sodium (Tergitol 7) et du 2,
3,5-triphenylterazoliumchloride (TTC) qui inhibe la plupart des
bactries Gram positif. Le tergitol 7 permet de slectionner les
coliformes et inhibe galement lenvahissement par Proteus. Le TTC
montre le pouvoir rducteur des bactries, il se manifeste par la
pigmentation des colonies. On peut ainsi discriminer E.coli et
Enterobacter aerogenes des autres coliformes, qui rduisent le TTC.
De plus, ce milieu donne une indication sur la capacit d'utiliser
le lactose, par la prsence d'un indicateur color de pH, le bleu de
bromothymol.
Proposition d'un protocole d'analyses bactriologiques de
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Ctrimide: La glose au ctrimide est un milieu slectif, qui permet
lisolement des Pseudomonas et notamment de P.aeruginosa. Ce milieu
glos est relativement pauvre, et contient un antiseptique : le
ctrimide (bromure de N-actyl-N, N, N-trimthylammonium).
Lutilisation de ce driv dammonium quaternaire comme agent slectif
produit une large inhibition des micro-organismes contaminants. La
concentration de 0,3 g/l inhibe suffisamment la flore
daccompagnement et permet une meilleure croissance des Pseudomonas.
La prsence d'acide nalidixique (inhibiteur de nombreuses bactries
Gram ngatif) permet de complter la slectivit. Ce milieu favorise la
production de pigments par P.aeruginosa (pyoverdine et pyocyanine).
TSC: Le TSC est un milieu slectif pour le dnombrement de
Clostridium perfringens ou des Clostridium sulfito-rducteurs. Le
tryptose, la peptone de farine de soja et lextrait de levure
assurent aux clostridies les meilleures possibilits de
dveloppement. Le citrate de fer ammoniacal et le sulfite de sodium
permettent de mettre en vidence les colonies productrices dH2S
(apparition de pigments noirs). La prsence d'un antibiotique, la
D-cyclosrine, donne au milieu une slectivit vis--vis de Clostridium
perfringens et en mme temps, diminue la taille des halos noirs
diffus et gnants autour des colonies de Clostridium perfringens.
Les colonies noires cultivant en profondeur peuvent tre des
Clostridium sulfito-rducteurs. La croissance 46C indique
Clostridium perfringens. 8. Mode opratoire 8.1. Prparation de
l'chantillon Pour les essais raliss, et afin de comparer les
rsultats entre les sdiments et la boue thermale, l'chantillon est
hydrat hauteur de 90% avec de l'eau physiologique strile. En
considrant une hydratation de 29% pour la boue thermale et 0% pour
des sdiments, sont rajouts, respectivement, 6.10mL ou 9mL d'eau
physiologique strile 1g de substrat. Suite un vortexage pendant
30sec, une agitation mcanique permet de finaliser l'chantillonnage
de 30min 300rpm. Cette condition a t dtermin comme tant optimale
pour l'obtention de l'chantillon analyser. Aucun agent chimique ou
physique n'a permis d'optimiser la rcupration de flores. 8.2.
Ensemencement/ Mthode de dnombrement/Incubation sur milieu
prsomptif La technique choisie pour raliser l'ensemencement est
l'talement au rteau. Ce mode d'ensemencement est une condition
dfinie, en comparaison un ensemencement aprs filtration ou par
inclusion. Il est galement important de raliser l'ensemencement ds
la fin de la prparation, une sdimentation de l'chantillon montre
une diminution d'un facteur 10 du nombre d'UFC dnombr. Aprs
incubation, le dnombrement de 100L d'chantillon se fait en UFC
(Unit Formant Colonie) ramen par gramme de substrat. Flore totale:
Afin d'valuer la quantit totale de microorganismes cultivables
prsente dans le substrat, des dilutions sries de raison 10 en eau
physiologique sont ncessaires avantProposition d'un protocole
d'analyses bactriologiques de substrats thermaux utiliss dans le
cadre d'application cutane
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l'ensemencement sur glose, de manire obtenir des entre 30 et 300
UFC dans les 100L dposs. Il est prconis de raliser des
ensemencements en triplicata pour palier un ventuel envahissement
de la surface glose. L'tude d'une cintique de croissance permet
d'tablir un dnombrement maximal de la flore 6j d'incubation mais ds
4j 90% des UFC sont mise en vidence Flore spcifique: En fonction du
seuil de dtection du microorganisme retrouv par gramme de sdiments
que le laboratoire veut s'imposer, la dilution de l'chantillon
ensemencer sur la glose peut tre variable. Diffrents essais ont
permis d'tablir les conditions suivantes: Les milieux de Chapman et
TTC ensemencs sont incubs 37C pendant 48h, la croissance est
prsente en 24h mais les pigmentations ne sont dtectables qu' partir
de 48h d'incubation. P.aeruginosa donne des colonies qui s'talent;
le dnombrement est donc facilit pour une lecture aprs 24h
d'incubation 37C, puis contrle 48h. Une atmosphre anarobie est
ncessaire pour la culture des clostridies, 37C pendant 3j.
8.3. Lecture Chapman: Observations Rsultat Colonie jaune/Halo
jaune Mannitol+ Colonie rouge MannitolConsidrer comme suspectes les
colonies qui prsentent, aprs incubation 37C, sur glose de Chapman,
une coloration jaune cerne d'un halo jaune. TTC: Observations
Rsultat Colonie jaunes orang/halo TTC+/- Lactose+ jaune Colonie
rose-rouge/halo jaune TTC+/Lactose+: Colonie rouge fonce TTC+
Lactose Interprtations Suspicion pour Escherichia coli ou
Enterobacter aerogenes Coliformes (autre que Escherichia coli et
Enterobacter aerogenes) Flore diverse
Considrer comme suspectes les colonies qui prsentent, aprs
incubation 44C, sur glose lactose au TTC et au tergitol 7, une
coloration jaune ou orange avec un halo jaune plus ou moins net.
Ctrimide: Observations Croissance Absence de croissance Virage du
milieu au bleu Virage du milieu au jaune-vert Rsultat Positif
Ngatif Production du pigment pyocyanine Production du pigment
pyoverdine
Proposition d'un protocole d'analyses bactriologiques de
substrats thermaux utiliss dans le cadre d'application cutane
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Considrer comme suspectes toutes les colonies prsentent, aprs
incubation 37C, sur glose ctrimide, et noter galement leur
pigmentation . TSC: Observations Rsultat Colonie noire/ halo noir
Rduction des sulfites Pas de coloration noire Pas de rduction des
sulfites Considrer comme Clostridium sulfito-rducteur, toute
colonie noire entoure d'un halo noir. Il est ncessaire de s'assurer
que la souche corresponde un bacille Gram positif. 8.4. Dtection et
identification des germes indicateurs A partir de colonies
suspectes obtenues sur milieu prsomptif, un isolement est ralis sur
ce mme milieu afin de pourvoir poursuivre avec un test confirmatif
8.5. Milieux confirmatifs et Lecture Afin de confirmer
l'appartenance de l'isolat un genre bactrien donn, il y a ncessit
de passer par un test confirmatif. Pour valider la prsence
S.aureus, il faut rechercher la prsence de l'activit catalase (NF
ISO 22148) et la prsence d'un coagulase A (NF ISO 22718). En tout
premier lieu, s'assurer que la souche prsente une morphologie en
coque Gram positif. Recherche de la catalase: A partir d'un
isolement, faire ragir une colonie dans 1 goutte de peroxyde
dhydrogne. L'apparition de dgagement de dioxygne (sous forme de
bulle) atteste de la prsence de la catalase au sein de la souche.
Recherche de la coagulase: Transfrer les colonies suspectes isoles
dans des tubes striles contenant chacun du plasma de lapin. Apres
incubation de 6h 37C+/-2C, constater ou non la coagulation du
plasma. Pour valider la prsence de coliformes, il faut rechercher
la tryptophanase. Cette enzyme permet de produire de l'indole
partir de tryptophane. La raction enzymatique entre
ledimthyl-amino-4-benzaldhyde (contenu dans le ractif de Kovacs) et
l'indole produit un compos rouge.
En tout premier lieu, s'assurer que la souche prsente une
morphologie en bacille Gram ngatif et oxydase ngative (cf. Test
confirmatif de P.aeruginosa). Recherche de le tryptophanase:
Transfrer les colonies suspectes isoles dans des tubes striles
contenant chacun du milieu ure-tryptophane. Apres incubation de 24h
37C+/-2C, ajouter du ractif de Kovacs dans le tube et observer si
une coloration rouge en anneau apparat. Pour valider la prsence de
Pseudomonas aeruginosa, s'assurer en tout premier lieu que la
souche prsente une morphologie en bacille Gram ngatif et oxydase
positive. Dans un second temps, il faut vrifier que la souche
produise la nitrate rductase. Recherche de l'oxydase:Proposition
d'un protocole d'analyses bactriologiques de substrats thermaux
utiliss dans le cadre d'application cutane
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L'oxydase, appele aussi la phnylne diamine oxydase, est une
enzyme permettant d'oxyder les drivs mthyls du paraphnylne diamine
(famille des cytochromes). De coloration incolore, le N dimthyl
paraphnylne diamine prend une coloration rose une fois oxyd, entre
5 et 10 sec. Recherche de l'oxydase: Humecter un papier filtre avec
le ractif (contenant le N dimthyl paraphnylne diamine). Prlever une
colonie isole et l'craser sur le support contenant le ractif.
L'apparition d'une coloration rose sur le papier filtre atteste de
la prsence de l'oxydase. Recherche de la nitrate rductase: Raliser
une suspension de la souche identifier dans du bouillon actamide
(contenant des nitrates) et incuber 24h 37C+/-2C avant d'ajouter
quelques gouttes de ractif de Nessler. Ce dernier permet de mettre
en vidence la prsence de cations ammonium (NH4+) issu de la
dgradation des nitrates en nitrites. Une coloration rouge-brique
est observe pour un rsultat positif en cas de prsence de la nitrate
rductase. Selon la norme ISO 22717 :2006, il est galement possible
de valider l'identification de P.aeruginosa si la souche sur milieu
prsomptif fluoresce sous une lampe ultraviolets. La prsence de
colonies typiques de Clostridium n'est pas soumise une confirmation
d'identification, notamment par leur croissance en anarobiose. 9.
Expression de rsultats/ Mode de calcul Il est prconis d'uniformiser
les rsultats en les exprimant par gramme de sdiments. En fonction
du niveau de qualit sanitaire que le laboratoire s'imposera en
contrle interne, des niveaux cibles sont mettre en place. Ils
doivent prendre en compte les limites de dtection lies la complexit
du traitement du substrat. La rglementation sur l'eau est une base
pour tablir les seuils de tolrance sur les analyses bactriologiques
(cf.Annexe2) 10. Rfrences bibliographiques > Eaux de
tablissements de sant, qualit de l'eau aux points d'usage, dit par
le Groupe Eau sant > L'eau dans les tablissements de sant, dit
par le ministre de la sant et des solidarits > Le guide du
thermalisme, le guide officiel des stations thermales franaises,
dit par le Groupe impact mdecine
Proposition d'un protocole d'analyses bactriologiques de
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11. Annexes Annexe 1 Trypcase-sojaPeptone de casine : Peptone de
farine de soja : Chlorure de sodium : Agar : pH : 7,3 0,2 15,0 g/l
5,0 g/l 5,0 g/l 15.0 g/l
Chapman
Peptone Extrait de viande de buf Chlorure de sodium Mannitol
Rouge de phnol Agar pH = 7,4
10,0 g/l 1,0 g/l 75,0 g/l 10,0 g/l 0,025 g/l 15,0 g
TTC Tergitol 7
Peptone Extrait de viande Extrait de levure Lactose Tergitol TTC
Bleu de bromothymol Agar pH = 7,2
10,0 g/l 5,0 g/l 6,0 g/l 20,0 g/l 710 mg/l 25 mg/l 50 mg/l 13,0
g/l
TSC
Tryptone Citrate de fer III ammoniacal Cyclosrine Disulfite de
sodium Agar
20,0 g/l 1,0 g/l 0,4 g/l 1,0 g/l 5,0 g/l
Ctrimide (Glose)
Peptone de glatine Peptone de casine Bromure de ttradonium
(ctrimide) Acide nalidixique Sulfate de potassium Chlorure de
magnsium Agar pH = 7,1
16,0 g/l 10,0 g/l 0,2 g/l 15,0 mg/l 10,0 g/l 1,4 g/l 10,0
g/l
Ure tryptophane
L-tryptophane Ure Hydrognophosphate de potassium
Dihydrognophosphate de potassium NaCl Alcool 95 Rouge de phnol
3g 20g 1g 1g 5g 10mL 25 mg
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Annexe 2 Recommandations/circulaires sur l'eau permettant
d'tablir des seuils de dtection des flores dans les substrats
thermaux: > Eau pour soin standard: A des fins alimentaires mais
galement pour des soins de base sur les patients sans risque et le
nettoyage de dispositifs mdicaux. Niveau cible Flore arobie
revivifiable 22C 100UFC/mL Flore arobie revivifiable 36C 10UFC/mL
Coliformes totaux
