Protéomique d’interaction

Plusieurs technologies :

Système double hybride

Copurification de protéines

Séparation directe des complexes

La protéine GAL4 est constituée de deux domaines  :

un domaine N-terminal qui lie spécifiquement une séquence d'ADN (UASG pour upstream activated sequence for the yeast Gal genes).

un domaine C-terminal contenant une région acide. Les charges négatives participent à l'activation transcriptionnelle.

Quand le facteur de transcription GAL4 se lie, il active la transcription du gène reporter.

La protéine GAL4

Le gène reporteur.Le gène reporteur le plus utilisé est le gène lacZ, qui code pour une enzyme, la -galactosidase.L'expression de lacZ peut-être mesurée par un colorimètre, selon le test de l' complémentation des levures basée sur l'activité de la -galactosidase.

NOM

Copurification de protéines

DETECTION

PURIFICATIONPROTEINE APPÂT

ETIQUETTE

6His

6His

Site de coupurepour la protease du TEV

Tobacco Etch Virus

GFP S65TBiais de codon optimisé pour la levure

FRET

Protease du TEV

Longueur d’onde (nm)

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

(uni

tés

arbi

trai

res)

AD

Y

AD

YX

FRET

X

Expression non toxique dans la levure

Transfert d’énergie de fluorescence par résonance

6His

Calmodulin binding peptide Site de coupurepour la protease du TEV

Tobacco Etch Virus

GFP S65TBiais de codon optimisé pour la levure

Obtention d’une souche exprimant la protéine de fusion

Phase de diagnostic

Phase de purificationPhase d’identification

Fragment PCR

Vecteur digéré

cotransformation

Recombinaisonhomologue stricte

Rq : les « accidents » de PCR (non sens et frameshift) sont contrôlés par la fluorescence

Obtention d’une souche exprimant la protéine de fusion

Chromatographie en gel d’exclusion

Préparation d’un extrait protéique

Comparaison entre le poids moléculaire calculé et mesuré

Obtention d’une souche exprimant la protéine de fusion

Phase de diagnostic

6His

6Hisx

GENESTailles de

la protéine de fusion

Taille théorique

des complexes

MAK10 114 175 110 62-27 165

MAK3 50 185-110 48 29 165

MAK31 40 175-105-58 29 165

STO1 130 170 ep 58-28 153

MUD13 53 175-110 64 153

TCP1 90 125 62-43-30 1000

TFC1 103 160 105 62-44 444-152

ADE4 86 330 épaulement 47-25

RVS167 83 170-110 60-22

RGD1 104 155 105 56-27

YNL300W 40 180-105-62 32

YER007C-A 50 135-66 34

YKR046C 61 158-100 59

YCR102C 70 125 88 46

YFR044C 82 160 90 54

YFR006W 91 160 50

YGL099W 102 160 110 58-28

YGR245C 116 140 90-52-25

YDL148C 124 180 96-54-25

YNL132W 149 165 96-55-26

RPN9 75 >670-560-94 60 31 391

PYC1 160 300 140 52

TKL1 103 300-140 52

MIP1 176 160 105-58-27

PDA1 78 310-98 54-29 270

ENO1 76 280-110 60-28 152-122

LPD1 84 150 60 119-240-262

PFK1 137 >670-660-155 60-36241-874-904-

934-964

TPI1 56 280-158 26

TRP1 54 110 60 29 108

Taille correspondant aux pics de fluorescence

En KDa

Chromatographie d’affinité 1

Chromatographie d’affinité 2

Obtention d’une souche exprimant la protéine de fusion

Phase de diagnostic

Phase de purification

HiTrap Chelating chargée en Ni

Calmodulin Binding Peptide Sepharose

(TEV protease)

Phase de purificationPhase d’identification

Séparation des éléments du complexe par électrophorèse

Digestion des bandes polypeptidiques par une protéase

Analyse des digestions au spectromètre de masse

Obtention d’une souche exprimant la protéine de fusion

Phase de diagnostic

116 00097 000

66 000

45 000

29 000

PDC6

PTC1

PRB1

POR1

THI2

YLR352W

SKP1

CDC53 TAG

GFP

ADE4

ADE4 TAG

Protéine inconnue

d’Arabidopsis thaliana

Protéinesde levure

GENES COMPLEXES GENES COMPLEXES GENES COMPLEXES GENES COMPLEXES GENES COMPLEXES

MAK10 MAK3 RPN9 pas de complexe mis en évidence SKP1YDR131C, CDC4, SGT1, PRB1,UFO1, CDC53, BOP2 RAD53

SWI4, ASF1,YMR135C, SMC3, TBF1,SRP1 NCR1 pas de complexe mis en évidence

MAK3 MAK 3, MAK10, MAK 31 PYC1 hétérodimère avec PYC2 RAD1 pas de complexe mis en évidence RAD54 MGE1 PMA1 pas de complexe mis en évidence

MAK31 pas de complexe mis en évidence TKL1 homodimères RAD10TIF2, RNR2, CPH1, ARC1, FUM1,SOD2 RAD55 PTC3 SCH9 pas de complexe mis en évidence

STO1STO1, YKL214C, SNU56, SRO9,BUR2, YDL175C, PRP40,PRP42,HTA1, MSH4, NAB3

MIP1 pas de complexe mis en évidence RAD14 CTF4, RAD16, RAD4 RAD57 pas de complexe mis en évidence SET1 BRE2

MUD13 pas de complexe mis en évidence PDA1 TIF2, PFK2, PFK1, LAT1 RAD16HTB2, RAD7, SHP1, TDH3,

VPS1,PDC1, PEP4 RAD59 SEC27 SGS1 pas de complexe mis en évidence

TCP1 pas de complexe mis en évidence ENO1 SSC1, ENO1 RAD17 pas de complexe mis en évidence RAD6 UBA1 SOD1 pas de complexe mis en évidence

TFC1 pas de complexe mis en évidence LPD1 TKL1 RAD18 pas de complexe mis en évidence RAD7 pas de complexe mis en évidence SSL1TFB3, TFB4, SPT7 CCL1, SSL1,CDC95, MRPS28, KAP95, TFA1,TFB1

ADE4 ADE4 (tétramères) PFK1 PFK1, PFK2 RAD2 PEX15 RAD9 DUN1 SSL2 STI1

RVS167 RVS161, YPL249C TPI1 homodimères RAD23 pas de complexe mis en évidence BDF2 BDF1 TEL1 YPL110C

RGD1 pas de complexe mis en évidence TRP1 pas de complexe mis en évidence RAD24YLR413W, TCP1, DUN1,RFC3, RPT3,RFC5, YJR072C CBK1 pas de complexe mis en évidence YDL085W pas de complexe mis en évidence

YNL300W pas de complexe mis en évidence SUR2 pas de complexe mis en évidence RAD26 pas de complexe mis en évidence CDC15 TFP1, AUT2 YMR145C pas de complexe mis en évidence

YER007C-A TFA1, ASC1, YER007C-A SUP35SUP35, ROM2, SUP45, TAO3,YJL017W, MRPL23, CLU1, ECM29,NAB3

RAD27 POL30 DUN1 HOM2, SOD1, ADH4, CPH1, PDX3 YPK1 pas de complexe mis en évidence

YKR046C pas de complexe mis en évidence CDC34 pas de complexe mis en évidence RAD28 TCP1, CCT6, DUN1 ESR1 pas de complexe mis en évidence BAS1 pas de complexe mis en évidence

YCR102C pas de complexe mis en évidence CDC4 SKP1 RAD3 pas de complexe mis en évidence FZF1 pas de complexe mis en évidence GRF10 pas de complexe mis en évidence

YFR044C pas de complexe mis en évidence CDC53PDC6, PTC1, PRB1, THI21, YBR280C, SKP1 RAD30 GPH1 GDI1 pas de complexe mis en évidence YOR155C pas de complexe mis en évidence

YFR006W dimères GRR1 pas de complexe mis en évidence RAD4 pas de complexe mis en évidence GUT1 pas de complexe mis en évidence BOI1 pas de complexe mis en évidence

YGL099W pas de complexe mis en évidence HRT1 pas de complexe mis en évidence RAD5 pas de complexe mis en évidence IRA2 pas de complexe mis en évidence BOI2 pas de complexe mis en évidence

YGR245C pas de complexe mis en évidence KEX2 pas de complexe mis en évidence RAD50 SEC27, MRE11 MLH1YOR155C, MGE1, SGS1, HDA1,MGM101, RFA2, , TOP3, VAS1,RNH1

SRA1 pas de complexe mis en évidence

YDL148C pas de complexe mis en évidence MET30 MET31, HRT1, MET4, CDC53 RAD51MLH1, CLU1, GCN20, GFA1,YHB1,RAD51 MSH2

RSC8,LCD1, MSH6, PLO1, PLO2,RNH1, CYR1 PHO81, ACT1, SRV2

YNL132W pas de complexe mis en évidence SGT2 pas de complexe mis en évidence RAD52 ALD5 MSH6SGS1, MEC1, RSC8,PLO1, PLO2,TOP3, VAS1 LAS17

RPN12, END3, YCR030C, SLA2,VMA1, VRP1, SLA1

8 partenaires4

10 partenaires2

11 partenaires1

12 partenaires1

7 partenaires5

6 partenaires1

5 partenaires3

4 partenaires5

3 partenaires6

2 partenaires15

hétérodimère1

tétramère1

homodimère2

Pas de complexe54

ObservationsNombre d’ORFs

100 ORFs

53%

GENES COMPLEXES

MAK10 MAK3

MAK3 MAK 3, MAK10, MAK 31

MAK31 pas de complexe mis en évidence

STO1STO1, YKL214C, SNU56, SRO9, BUR2, YDL175C, PRP40, PRP42,HTA1, MSH4, NAB3

MUD13 pas de complexe mis en évidence

TCP1 pas de complexe mis en évidence

TFC1 pas de complexe mis en évidence

ADE4 ADE4 (tétramères)

RVS167 RVS161, YPL249C

RGD1 pas de complexe mis en évidence

YNL300W pas de complexe mis en évidence

YER007C-A TFA1, ASC1, YER007C-A

YKR046C pas de complexe mis en évidence

YCR102C pas de complexe mis en évidence

YFR044C pas de complexe mis en évidence

YFR006W dimères

YGL099W pas de complexe mis en évidence

YGR245C pas de complexe mis en évidence

YDL148C pas de complexe mis en évidence

YNL132W pas de complexe mis en évidence

+ MAK31 Cellzome

11 protéines / 34 protéines Cellzome

Avantage GFP

Avantage GFP

7 protéines Cellzome

26 protéines MDS Proteomics

GENES COMPLEXES

RPN9 pas de complexe mis en évidence

PYC1 hétérodimère avec PYC2

TKL1 homodimères

MIP1 pas de complexe mis en évidence

PDA1 TIF2, PFK2, PFK1, LAT1

ENO1 SSC1, ENO1

LPD1 TKL1

PFK1 PFK1, PFK2

TPI1 homodimères

TRP1 pas de complexe mis en évidence

SUR2 pas de complexe mis en évidence

SUP35 SUP35, ROM2, SUP45, TAO3, YJL017W, MRPL23, CLU1, ECM29, NAB3

CDC34 pas de complexe mis en évidence

CDC4 SKP1

CDC53 PDC6, PTC1, PRB1, THI21, YBR280C, SKP1

GRR1 pas de complexe mis en évidence

HRT1 pas de complexe mis en évidence

KEX2 pas de complexe mis en évidence

MET30 MET31, HRT1, MET4, CDC53

SGT2 pas de complexe mis en évidence

PDC6, PTC1, PRB1, POR1, YLR352W, THI21, YBR280C, SKP1, PDC5MDS Proteomics

GENES COMPLEXES

SKP1 YDR131C, CDC4, SGT1, PRB1, UFO1, CDC53, BOP2

RAD1 pas de complexe mis en évidence

RAD10 TIF2, RNR2, CPH1, ARC1, FUM1, SOD2

RAD14 CTF4, RAD16, RAD4

RAD16 HTB2, RAD7, SHP1, TDH3, VPS1,PDC1, PEP4

RAD17 pas de complexe mis en évidence

RAD18 pas de complexe mis en évidence

RAD2 PEX15

RAD23 pas de complexe mis en évidence

RAD24 YLR413W, TCP1, DUN1,RFC3, RPT3, RFC5, YJR072C

RAD26 pas de complexe mis en évidence

RAD27 POL30

RAD28 TCP1, CCT6, DUN1

RAD3 pas de complexe mis en évidence

RAD30 GPH1

RAD4 pas de complexe mis en évidence

RAD5 pas de complexe mis en évidence

RAD50 SEC27, MRE11

RAD51 MLH1, CLU1, GCN20, GFA1, YHB1,RAD51

RAD52 ALD5

YDR131C, CDC4, SGT1, PRB1, UFO1, CDC53, BOP2MDS Proteomics

GENES COMPLEXES

RAD53 SWI4, ASF1,YMR135C, SMC3, TBF1, SRP1

RAD54 MGE1

RAD55 PTC3

RAD57 pas de complexe mis en évidence

RAD59 SEC27

RAD6 UBA1

RAD7 pas de complexe mis en évidence

RAD9 DUN1

BDF2 BDF1

CBK1 pas de complexe mis en évidence

CDC15 TFP1, AUT2

DUN1 HOM2, SOD1, ADH4, CPH1, PDX3

ESR1 pas de complexe mis en évidence

FZF1 pas de complexe mis en évidence

GDI1 pas de complexe mis en évidence

GUT1 pas de complexe mis en évidence

IRA2 pas de complexe mis en évidence

MLH1 YOR155C, MGE1, SGS1, HDA1, MGM101, RFA2, , TOP3, VAS1, RNH1

MSH2 RSC8,LCD1, MSH6, PLO1, PLO2, RNH1,

MSH6 SGS1, MEC1, RSC8,PLO1, PLO2, TOP3, VAS1

GENES COMPLEXES

NCR1 pas de complexe mis en évidence

PMA1 pas de complexe mis en évidence

SCH9 pas de complexe mis en évidence

SET1 BRE2

SGS1 pas de complexe mis en évidence

SOD1 pas de complexe mis en évidence

SSL1 TFB3, TFB4, SPT7 CCL1, SSL1, CDC95, MRPS28, KAP95, TFA1, TFB1

SSL2 STI1

TEL1 YPL110C

YDL085W pas de complexe mis en évidence

YMR145C pas de complexe mis en évidence

YPK1 pas de complexe mis en évidence

BAS1 pas de complexe mis en évidence

GRF10 pas de complexe mis en évidence

YOR155C pas de complexe mis en évidence

BOI1 pas de complexe mis en évidence

BOI2 pas de complexe mis en évidence

SRA1 pas de complexe mis en évidence

CYR1 PHO81, ACT1, SRV2

LAS17 RPN12, END3, YCR030C, SLA2, VMA1, VRP1, SLA1

Au moins 5 méthodes de copurification:

Système TAP Tag (Cellzome)

Système Flag Tag (MDS Proteomics)

Système CHH Tag (CSHL)

Système GFP TAP Tag (Bordeaux)

Système HisMyc Tag (John Yates)

Appât-CBP-TEVtarget-ZZ

Appât-flag tag

Appât-CBP-6His-3Ha

Appât-GFP-CBP-TEVtarget-6His

Appât-His8-TEV target-Myc9

Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry. Ho et al

10 janvier 2002 Fonctional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Gavin et al

L’addition systématique d’une étiquette à une protéine appât constitue une limite

pour les approches globales

14182 interactions protéine-protéine(299)

Cellzome

MDS Proteomics

Séparation directe des complexes

Séparation par chromatographie bidimensionnelle des complexes protéiques stabilisés par un agent pontant

Purification et identification des peptides impliqués dans les complexes protéiques

Après la lyse des cellules les protéines sont récupérées

Puis les complexes protéiques sont stabilisés en utilisant un agent pontant (dithiosuccinimidylpropionate)

0 0.5 1 1.5 2 4 6 8

DSP (mM)

Solubilisation sans mercaptoéthanol

Les complexes protéiques stabilisés sont séparés selon leur charge en utilisant un Rotofor

0

2

4

6

8

10

12

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

tubes

DO

280

nm

2345678910

pH

0

5

10

15

20

25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

tubes

DO

28

0 n

m

0

2

4

6

8

10

12

14

pH

20 – 3 + 20 = 37 fractions

Ampholines pH 3,5-10

Sans Ampholines

Chaque fractions issues du Rotofor sont séparées selon la taille par chromatographie

d’exclusion (Superdex200)

37 chromatographies

1850 fractions

Charge

Ma

sse

MALDI - TOF

-Mercaptoethanol

Trypsine

MALDI - TOF

MALDI - TOF

Données

Données

Données

LC/MS/MS Données

Séparation directe des complexes

Séparation par chromatographie bidimensionnelle des complexes protéiques stabilisés par un agent pontant

Purification et identification des peptides impliqués dans les complexes protéiques

Après la lyse des cellules les protéines sont récupérées

Biotine

Groupes réactifs capables de se fixer aux –NH2

Biotine

Groupes réactifs capables de se fixer aux –NH2

Congrès ASMS 2001 Michelle Trester-Zedlitz et al

Faisabilité sur un complexe

Biotine

Groupes réactifs capables de se fixer aux –NH2

Protéolyse spécifique des

protéines

Purification par affinité des peptides(avidine sépharose)

Identification des peptides associés

Mêmeprotéine

Protéinesdifférentes

Analyse par spectrométriede masse (LC/MS/MS)

3 méthodologies :

Copurification de protéines étiquetées(proposé en service et en développement Helicobacter pilori)

Séparation des complexes stabilisés par chromatographie liquide bidimensionnelle

Purification et identification des peptides impliqués dans les complexes protéiques(stade du développement de la molécule)

ProteinChips