Revue Fransaise de Transfusion et Immuno-hfmatologie Tome XXVI - - N ° 2 - - 1983 123

MEMOIRES ORIGINA UX

Purification de la fibronectine humaine

par prdcipitation et immunoadsorption

p a r J . P . A l l a in , A. L e j a r s , C . T . P h a m , A. G a i l l a n d r e et H . H . Lee

Centre National de Transfusion Sanguine, PARIS

I N T R O D U C T I O N

L A f ibronect ine est une prot6ine ubiqui taire , pr6sente au niveau cellulaire et en ci rculat ion darts le p lasma. Les fonct ions de cet te

prot6ine sont mult iples . Elle in tervient dans la f ixation et la crois- sance cellulaire, l 'opsonisa t ion des bactdries, l ' i n f l ammat ion et la rdpa- ra t ion des tissus, l 'h6mostase et la coagulat ion [6-8]. Certaines publi- cations ont mont r6 que l ' appor t de f ibronect ine, le plus souvent sous fo rme de cryoprdcipi t6 pouvai t avoir une utilitd clinique dans les septic6mies, les brfilures, les in tervent ions chirurgicales [7, 9].

La l i t t6ra ture r appo r t e d 'une par t , des m6tfiodes de pur i f ica t ion de la f ibronect ine p l a sma t ique pa r pr6cipi ta t ion [5] puis pa r chroma- tographie d 'aff ini t6 ut i l isant la g61atine c o m m e ligand [10]. D 'au t re par t , les cliniciens ont utilis6 un mat6r ie l re la t ivement peu purif i6 de f ibronect ine (!e cryopr6cipit6) la issant p laner un doute sur la responsabi l i t6 directe de cet te prot6ine dans les rdsul tats thdrapeu- tiques.

Manuscrit re~u le 25-1-1983.

124 A L L A 1 N J.P. et coll.

Nous avons mis au point des techniques s imples de pur i f ica t ion de la f ibronect ine adaptab les g une large 6chelle en rue de l 'obtent ion d 'un concentr6 th6rapeut ique sp6cifique. Nous avons 6galement ob tenu par une pr6cipi ta t ion addi t ionnel le et i m m u n o a d s o r p t i o n des pr6pa- ra t ions de f ibronect ine de haute puret6.

MATERIEL ET M E T H O D E S

Les produi t s chimiques utilis6s sont de puret6 analyt ique et obte- nus chez Merck ou Prolabo.

Le dosage des prot6ines est r6alis6 pa r la m6thode du biuret , le dosage du f ibr inogbne par une m~thode gravim6tr ique aprbs coagu- lat ion pa r la th rombine .

Les IgG sont test6es pa r immunod i f fus ion radiale. Le fac teur V I I I : R A g est dosd pa r immunod lec t rophorbse selon la m6thode de LAURELL [4].

Le p l a sma ddpourvu de f ibronect ine est ob tenu par chromato- graphie d 'un pool de p l a s m a no rma l sur colonne de g~latine S6pharose 4B (Pharmacia) , l 'ef f luent est lyophilis~ pa r pet i tes fractions.

Dosage de la f ibronect ine

Un an t i s6 rum ant i - f ibronect ine a 6t6 ob tenu chez le lapin pa r 4 inject ions sous-cutan~es d 'un m61ange de 0,5-1 mg de f ibronect ine purif i6e et d ' ad juvan t comple t de Freund ~t 1 semaine d ' intervalle. Apr~s 2 rappels h la ~ 5 et 7 ~ semaine, le s6rum est recueilli au 8 ~ jour , puis absorb6 par un m61ange ~t vo lume 6gal de p l a sma d6pourvu de f ibronect ine. Apr~s cent r i fugat ion le surnageant est test~ pour sa monosp6cif ic i t6 pa r contre- immuno-61ectrophorbse et immunodlec- t rophorbse b id imensionnel le [3] cont re des p lasmas , de suje t normal , de sujets a t te ints de maladie de Wil lebrand s6vbre, d 'af ibr inog6ndmie cong6nitale et contre du p l a s m a sans f ibronect ine. Les dosages propre- men t dits sont r6alisds pa r immuno61ect rophorbse selon LAURELL [4] en ut i l isant c o m m e r6f6rence, 4 dilutions (1 : 2 - 1 : 16) d 'un s t andard commerc ia l (Behring) 6talonn6 h 0.27 rag/m1. Les r6sul tats sont expr im6s en m g / m l .

M6thodes d'analyse des diff6rentes pr6parations de f ibronect ine :

- - i m m u n o - ~ l e c t r o p h o r b s e bidimensionnel le [3]. La concentra- t ion d ' an t i s6 rum dans le gel de la seconde dimension est de 20 txl/ml. Les dur6es d 'd lec t rophorbse sont de 2 h 30 h 10 mA/p laque dans la

P U R I F I C A T I O N DE L A F 1 B R O N E C T I N E 125

premi6re d imension et de 18 h /~ 10 mA/p laque dans la deuxibme dimension.

- - 61ectrophor6se en gradient de polyacrylamide. 100 txg de pro- t6ines sous un vo lume de 5 h 10 Ixl sont appliqu6s sur un gel de 1,5 m m d '6paisseur f o r m a n t un gradient de 3-15 % d 'acry lamide en pr6sence de 0 , 1 % SDS. Les 6chantil lons sont appliquds non r6duits ou r6duits 5 minutes h 50 ° C pa r 10 % de mercapto-6thanol . Apr6s une migra t ion de 18 h e n t a m p o n Tris 0,025 M, glycine 0,192 M, SDS 0 , 1 % , p H 8,3, les gels sont colords pa r le Bleu de Coomassie.

Digestion trypsique

Certains 6chantil lons ont subi une digestion enzymat ique pa r la t ryps ine (Sigma) ~ 0,6 % (w/w) h 37 ° C. Des 6chantil lons du m61ange sont pr~lev~s h diff~rents intervalles. Apr~s blocage de la r~action pa r 15 mM DFP et 6 % Soybean Tryps in inhibi tor (Sigma), une par t i e des 6chantil lons est r6duite et soumise ~ une ~lectrophor~se en gel de po lyacry lamide dans les condit ions d6crites pr~c~demment .

M6hode de purification

Les mat6r iaux de d6par t utilis6s dans ce t ravai l sont d6riv6s du cryopr6cipi t6 ob tenu selon la proc6dure s tandard utilis6e au CNTS pour la p r6para t ion des d~riv6s riches en fac teur V I I I : les p l a smas humains sont d6congel& len tement h 2-4 ° C puis m61ang6s en pool de 220 h 660 1. La pfite de c ryopr6c ip i t6 recueillie pa r cent r i fugat ion est soumise h deux types de t r a i t emen t diff6rents selon la m6thode de pur i f ica t ion du fac teur V I I I utilis~e.

a) Le cryopr~cipit6 est dissous dans un t a m p o n 0.2 M NaC1, 0.02 M ci t ra te de sodium, p H 7,0. Apr~s cent r i fugat ion p e r m e t t a n t d'61iminer le mater ie l insoluble, le su rnagean t est pr~cipit6 pa r le poly6thyl6ne glycol (PEG) 6 000 ~ 3,7 % (poids /vo lume) h 20 ° C. Le pr6cipit~ est s6par~ pa r cent r i fugat ion et recuei l l i ; il const i tue le mater ie l de d6par t pou r la pr6parfi t ion de f ibronect ine type I.

b) La pfite de cryopr6cipi t6 est soumise h une ext ract ion pa r agita- t ion m6canique dans un t a m p o n 0,02 M Tris-HC1, pH 6,6 h 20 ° C. Apr~s adsorp t ion pa r l 'hydroxyde d 'a lumine (Alhydrogel 1 % final) cet te suspens ion est filtr~e sur gaze et centrifug~e pou r ~liminer tous les ~16ments insolubles. Le p H est a just6 h 6,6 et la solution est refroidie r ap idemen t h 10 ° C et ma in tenue h cet te t emp6ra tu re pendan t 15 minutes . Le prdcipit6 form6 est s~par6 pa r cent r i fugat ion et const i tue le mat6riel de ddpar t p o u r la p rdpara t ion de f ibronect ine type II .

126 A L L A I N Y.P. et coll.

Pr6paration du concentr6 1 type I e t type I I

La technique dEcrite ci-dessous est ident ique p o u r les p repa ra t ions de f ibronect ine type I e t I I .

Le prEcipitE est dissous dans un t a m p o n 0,2 M NaC1, 0,02 M ci t ra te Na t r isodique, pH 7,5 et la concen t ra t ion protEique ajustEe

10 - 2 m g / m l . La solut ion est chauffEe h 50 - 2 ° C au bain-marie sous agi ta t ion magnEtique vigoureuse. Le prEcipitE i m p o r t a n t formE est Elimin6 pa r f i l t ra t ion et le su rnagean t est refroidi au bain-marie carboglace alcool jusqu 'h 20 ° C. L 'addi t ion de 10 % (w/v) PEG 4 000 (Merck) p rovoque la fo rma t ion d 'un prEcipitE qui est sEparE de la phase liquide pa r cent r i fugat ion sur Sharples h 35 000 t / m i n u t e avec un debi t d ' a l imenta t ion de 500 m l / m i n . Le prEcipitE collectE est dis- sous darts un t a m p o n 0,1 M glycine, c i t ra te 0,02 M, NaC1 0,1 M, p H 7. Apr6s cent r i fugat ion h 2 000 g pendan t 10 rain. h 20 ° C, le su rnagean t peu t ~tre soumis soit h une Etape addi t ionnel le de pur i f ica t ion soit ~t une f i l t ra t ion clar i f iante et stErilisante et h une lyophilisation.

Pr6paration du concentr6 2

La solut ion protEique ob tenue ~ l 'Etape prEcEdente est l en tement acidifide pa r l 'acide ci t r ique 0,1 M jusqu 'h p H 5.6. Le prEcipit6 ob tenu est lave avec H20 et dissous dans un t a m p o n ci t ra te 0,02 M, NaC1 0,1 M, p H 7 con tenan t des additifs. Apr6s centr i fugat ion, le surnageant est filtrE et lyophilisE c o m m e pour le concentr6.

Purification de la fibronectine par immunoadsorption

Nous avons utilis6 un liquide d 'asci te de souris con tenan t un an t icorps monoclonal ant i - f ibronect ine sp6cifique (clone 120 A 317 A4, IgG de sous-classe Y1). Les IgG sont purifiEes pa r ch roma tog raph ie sur DEAE-Sepharose CL 6B (Pharmacia) . Le pic con tenan t les IgG est recueilli et cont ient 85-90 % d'IgG. Cette p repa ra t ion est immo- bilisEe sur SEpharose 4B CNBr h ra ison de 5 mg de protEines pa r ml de gel selon la mEthode r ecommandEe par le fabr icant . La m~me colonne d ' i m m u n o a d s o r b a n t a 6t6 utilisEe p o u r toutes les experiences. 0,6 ml d 'un lot de concentr6 1 ont 6t6 mis en contac t avec le gel h 20 ° C pendan t 18 h. Apr6s lavage pa r un t a m p o n Tris-HC1 0,05 M, 0,15 M NaC1, pH 7,5, les ProtEines sont 61uEes pa r un t a m p o n 0,1 M glycine, 0,3 M NaC1 p H 2,4. Les f ract ions de 0,5 ml sont recueill ies dans des tubes p las t ique con tenan t 50 ~1 de Tris base 2 M, p H 8,0 p e r m e t t a n t de neut ra l i ser i m m E d i a t e m e n t l'61uat. La f rac t ion co r re spondan t h la densit6 opt ique m a x i m u m a ErE re tenue pour analyse.

PURIFICATION DE LA F1BRONECT1NE 127

RESULTATS

Pr6paration et analyse des concentr6s de f ibronect ine

Le tab leau I indique les concent ra t ions en prot6ines, f ibrinog~ne et f ibronect ine au cours des pr incipales 6tapes de p r6para t ion du concentr6 1 ~t pa r t i r du mat6r ie l de d6par t de type I e t de type I I . Les r endemen t s en f ibronect ine ont 6t6 calcu16s pa r r a p p o r t ~t la quanti t6 contenue dans le p l a s m a de d6par t (0,27 mg /ml ) . On no te que les concentr6s obtenus h pa r t i r des deux types de pr6cipit6 init iaux sont de compos i t ion similaire. La f ibronect ine repr6sente environ 90 % des prot6ines dans les deux cas. Le r endemen t final du concentr6 pr6par6 h pa r t i r du pr6cipit6 de type I I est environ 50 % de celui du type I. Ceci co r respond aux quanti t6s de fibro- nect ine contenues respec t ivement dans le pr6cipit6 PEG 3,7 % et le pr6cipit6 ~ 10 ° C dont les pourcen tages en f ibrinog~ne et en fibro- nect ine sont for t diff6rents. La reproduct ibi l i t6 de la m6thode est bonne (-+ 15 %).

TABLEAU I

Prdparation du concentrd 1 de fibronectine.

ETAPE DE PURIFICATION

Cryopr6cipi t6 . .

Type I.

! Pr6cipi t6 3,7 % P E G * solubil is6

S u r n a g e a n t apr~s chauf- fage

Concen t r6

Type II .

Pr6cipit6 /i f ro id *** ..

S u r n a g e a n t aprbs chauf- fage

Concent r6

PRO~INI~ m g / m l

14,6

11,2

3,4 20,8

30,6

10,3

23,5

FIBRINO6~NE m g / m l

11,2

8,6

ND **

ND **

16,8

ND **

ND **

FIBRONECTINE rag/m1

2,25

1,6

1,55 19

9,7

8,1

21,5

RENDEMENT %

58 •

31,7

19,6

12,1

15,5

10,1

6,35

* Moyenne de 8 lots cons6cut i fs .

** N o n d6tec table .

*** Moyenne de 4 lo ts cons6cut i fs .

128 ALLAIN J.P. et coll.

Le t a b l e a u I I m o n t r e la c o m p o s i t i o n des c o n c e n t r 6 s 1 e t 2. La p u r e t d de la p r d p a r a t i o n a u g m e n t e de 90 h e n v i r o n 97 % (96-99) d a n s le c o n c e n t r 6 2. L ' 6 t a p e a d d i t i o n n e l l e de p u r i f i c a t i o n p e r m e t d'61imi- n e r e n v i r o n 40 % d u f a c t e u r V I I I : RAg et 50 % des i m m u n o g l o b u l i n e s G c o n t e n u e s d a n s le c o n c e n t r 6 1 de t y p e I . Le r e n d e m e n t de pu r i - f i c a t i o n d u c o n c e n t r 6 2 h p a r t i r d u c o n c e n t r 6 1 es t d ' e n v i r o n 50 % avec de l a rge s v a r i a t i o n s (40 h 80 %).

TABLEAU II Composition des concentrds de fibronectine.

Concentr6 1 . .

Concentr6 2 . . . . . .

PROT~INES

mg/ml

Type I 20,8 TypelI 23,5

12,5

FIBRONEC-

TINE

mg/ml

19 21

12,1

PUP, nT~ %

91 89,4

97

F VIII R : A g u/m1

5,6 7,7

2,4

IgG mg/ml

0,26

Allo- agglutinines

Anti-A Anti-B Inverse du titre

0,9 16 8 2,1 32 16

1 0

L ' a n a l y s e i m m u n o 6 1 e c t r o p h o r 6 t i q u e des "concentr6s 1 et 2 (FIG. 1) i n d i q u e u n e m i g r a t i o n s i m i l a i r e h ce l le de la f i b r o n e c t i n e p l a s m a t i q u e . Les p r o p o r t i o n s r e s p e c t i v e s en f i b r o n e c t i n e de m i g r a t i o n l e n t e e t r a p i d e v a r i e n t p a r r a p p o r t a u p l a s m a . E n gel de p o l y a c r y l a m i d e

FIG. 1. - - Migration 61ectroph0rdtique en Laurell bidimensionnel de la fibronectine du plasma et de trois pr6parations de fibronectine. PN: Plasma normal, C 1 :Concent r6 1, C 2 :Concen t r6 2, IA: Immuno-adsorbd.

P U R I F I C A T I O N D E L A F I B R O N E C T I N E 129

(FIG. 2) on n o t e la d i s p a r i t i o n p r o g r e s s i v e des c o n t a m i n a n t s d u c o n c e n t r d 1 au c o n c e n t r e 2 e t ~t la f i b r o n e c t i n e o b t e n u e p a r i m m u n o a d - s o r p t i o n . Dans le gel n o n r d d u i t (F~c. 2) on n o t e u n e p r o p o r t i o n n o n n6g l igeab le de p r o d u i t s de d ~ g r a d a t i o n e t de m o n o m ~ r e s de f ib ro - n e c t i n e 200-220 kd) d a n s les 3 p r 6 p a r a t i o n s . La p r 6 p a r a t i o n i m m u n o a d - so rb6e c o n t i e n t e x c l u s i v e m e n t de la f i b r o n e c t i n e m o n o , d i m 6 r i q u e et des p r o d u i t s de d 6 g r a d a t i o n de la f i b r o n e c t i n e .

Fro. 2. - - Electrophor6se en gel de polyacrylamide (gradient 5-15 %) de fibronectine h diff6rents stades de purification. S : Standard - C 1 : Concentr6 1 - C 2 : Concentr6 2 - IA : Immuno- adsorb6.

La p r d s e n c e de f r a g m e n t s de f i b r o n e c t i n e d a n s le c o n c e n t r d 2 es t c o n f i r m 6 e p a r d l e c t r o p h o r 6 s e en gel de p o l y a c r y l a m i d e (FIG. 3). S u r le c o n c e n t r 6 n o n r6du i t , on n o t e la p r d s e n c e de p l u s i e u r s b a n d e s m i n e u r e s d a n s la zone des p o i d s m o l d c u l a i r e s 180-220 k d co r res - p o n d a n t p o u r u n e p a r t h des m o n o m 6 r e s de f i b r o n e c t i n e et p o u r u n e a u t r e p a r t ~t des p r o d u i t s de d 6 g r a d a t i o n de p o i d s m o l d c u l a i r e iden- t i q u e h ceux o b t e n u s a u d d b u t (1-3 rain.) de la d i g e s t i o n t r y p s i q u e (FIG. 3). Apr6s r d d u c t i o n on r e t r o u v e p l u s i e u r s f r a g m e n t s de p e t i t s p o i d s m o l 6 c u l a i r e (60-70 kd) darts la m 6 m e p o s i t i o n que c e r t a i n s f rag-

130 A L L A I N J.P. et coll.

m e n t s obse rves dans les ~chan t i l l ons pr6coces de la d iges t ion t ryp- s ique.

FIG. 3. - - Page de fibronectine, concentrd 2. Electrophor~se en gel de polyacrylamide du concentr6 de fibronectine 2 natif et apr6s diffdrents temps de digestion par la trypsine avec et sans rdduction par le mercapto~thanol. S - Standard. F - Concentr~ 2. 1 - 1 rain de protdolyse. 2,3 et 120 min de protdolyse.

Purification par immunoadsorption

U n exemple r ep r~sen t a t i f de p u r i f i c a t i o n de la f i b r o n e c t i n e p a r i m m u n o a d s o r p t i o n su r a n t i c o r p s m o n o c l o n a l i m m o b i l i s ~ est m o n t r 6 su r la f igure 4. Apr~s raise en c o n t a c t de 6 mg de f i b r o n e c t i n e concen- tr6e avec le gel et lavage extensi f , u n pic tr6s d t ro i t de p ro td ines est dlu6 h p H 2,4. U n prof i l d ' d lu t i on t r6s s imi l a i r e est o b t e n u avec du p l a s m a n o r m a l .

Su r gel de p o l y a c r y l a m i d e (FIG. 2), les p ro t~ ines 6ludes et concen- t rdes ~t 1 m g / m l se p r d s e n t e n t sous la f o r m e d ' u n e b a n d e m a j e u r e

P U R I F I C A T I O N DE L A F1BRONECT1NE 131

de poids mol6culai re de 440 000 et de 4 bandes dans la r6gion 200- 220 kd. Les deux bandes m6dianes sont les 2 monombres de fibro- nectine, la bande sup6rieure et la bande inf6rieure sont des produi t s

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VOLUME ELUTION (ml.)

Fig. 4. - - C h r o m a t o g r a p h i e s u r u n i m m u n o a d s o r b a n t ( a n t i c o r p s mono- c lona l a n t i - f i b r o n e c t i n e 120 A li6 au S 4 p h a r o s e 4B) du c o n c e n t r 6 de f i b r o n e c t i n e 1.

de d6gradat ion de la f ibronect ine reconnus pa r l ' ant icorps mono- clonal. La presence de d6 te rminants antig6niques sp6cifiques de la f ibronect ine sur chacune de ces qua t re bandes a 6t6 d6montr6e pa r la technique de t r ans fe r t des prot6ines sur ni trocel lulose et r6v61ation pa r un ant icorps monoclonal ant i f ibronect ine marqu6 h la peroxidase.

Etude fonctionnelle pr61iminaire du concentr6 1 e t 2

La capacit6 opsonisante d 'un lot repr6senta t i f de chaque concentr6 a 6t6 6tudi6 pa r le Dr T. PHAM Huu (Labora to i re d 'H6matologie , CHU, Bichat, Paris). Les r6sul tats pr61iminaires indiquent que la chemolu- minescence des polynuc16aires neutrophi les activ6s p a r le zymosan est augment6e d 'envi ron 10 fois en pr6sence de f ibronect ine et d'en- viron 14 fois en pr6sence de s6rum hum a in no rma l pa r r appo r t au

132 A L L A I N J.P. et coll.

contr61e. De m~me, en prdsence de staphylocoques opsonis6s par les concentr6s de fibronectine, la c h e m o l u m i n e s c e n c e augmente de 5 ~t 15 lois en pr6sence des concentr6s 1 et 2 respectivement.

Le r61e du concentr6 2 de f ibronectine dans l ' a t tachement des cellules de carcinome embryonnai re lors de leur diff6renciation en neurone en milieu de culture sans s6rum a 6t6 6tudi6e par M. DARMON (Inst i tu t Pasteur, Paris) [1]. L 'a t tachement des cellules est d~pen- dant de la concentra t ion en f ibronectine avec un op t imum h la concentra t ion de 10 ~g par ml de milieu.

DISCUSSION

La plupar t des m6thodes de purif ication de la f ibronectine plasma- tique humaine d6crite darts la l i t t6rature utilisent la chromatographie d'affinit6. Cette m6thode repose sur l 'affinit6 tr6s particuli6re de la f ibronectine pour la g61atine [1, 10]. Cependant cette technique 616gante ne permet pas d 'obtenir di rectement une fibronectine plus de 90 % pure et sur tout est assez real adapt6e ~ l'6chelle industrielle du fait de son cofit et des difficultds rencontr6es pour obtenir des produi ts apyrog6nes injectables ~ l 'homme.

D6s les premi6res 6tudes de MOSESSON, le cryopr6cipit6 a 6t6 reconnu comme fiche en f ibronectine et utilis6 comme 6tape initiale de purif ication de cette prot6ine [5]. Les m6thodes d6crites dans notre article ont permis d 'obtenir des concentrds de fibronectine, h deux degr~s diff6rents de puret6, h une 6chelle industrielle.

Le concentr6 1 h 90 % de puret6 est obtenu par une mdthode rapide et h rendement 61ev6. Cette pr6parat ion satisfait ais6ment aux tests 16gaux de contr61e de qualit6 appliqu6s aux produi ts th6ra- peutiques injectables d'origine humaine. Elle est donc destin6e au t ra i tement par vole intra-veineuse des ddficits en fibronectine. Le concentr6 2 a u n e purer6 sup~rieure ~t 95 %, nn rendement ne t tement inf6rieur au pr6c6dent concentr6 et la m6thode de prepara t ion s 'adapte assez real aux bonnes prat iques de fabricat ion des produi ts injectables ~t l ' h o m m e . Pourtant , la tr6s haute purer6, la stdrilit6, le bon compor tement sous forme lyophilis6e et la conservation des fonc- tions de cette f ibronectine en font un excellent r6actif pour la culture des cellules humaines en milieu sans s~rum.

La fibronectine apparemment pure obtenue par immunoadsorp t ion sur anticorps monoclonal spdcifique immobilis6 peut ~tre utilis~e pour l ' immunisat ion d 'animaux dans le but de pr6parer un ant is6rum sp6cifique anti-fibronectine.

PURIFICATION DE LA F1BRONECTINE 133

RESUME

Deux concentrds de fibronectine plasmatique humaine ont 6t6 obtenus par des mdthodes simples de prdcipitation. Le premier est constitu6 d 'environ 90 % de fibronectine pour l 'essentiel sous forme dim4r ique; sa pr4parat ion ais6e, son rendement 61ev4 et le main- tien du pouvoir opsonisant, destinent ce concentr4 ~ la thdrapeutique humaine par vole intra-veineuse. Le second contient 95-98 % de fibro- nectine sous forme de dim6res contamin4s par de faibles quantit6s de monom6res et de produi ts de d6gradation de la fibronectine. Ce produit semble bien adapt4 aux exigences de la culture cellulaire. Une prepara t ion de fibronectine apparemment pure a 6galement 6t6 obtenue par immunoadsorp t ion sur un anticorps monoclonal anti- f ibronectine immobilis6 sur un gel d'agarose.

SUMMARY

Two types of human plasma fibronectin concentrate were" obtained by simple, large scale, precipitat ion methods. Concentrate 1 contains 90% pure f ibronectin in a mainly dimeric form. This easy, high yield method provides a functional f ibronectin suitable for intravenous therapeutic purposes in deficient patients. Concentrate 2 contains 95-98 % pure f ibronectin with minimal amounts of f ibronectin mono- mer and degradation products. I t seems well adapted to serum free cultures of human cells. A third prepara t ion of an apparent ly pure f ibronectin has also been obtained by immuno-adsorpt ion with a Sepharose 4B column to which has been coupled an anti-fibronectin monoclonal antibody. The capture of dimer, monomers and degra- dation products by this ant ibody and their release at pH 2.4 has been demonst ra ted by gel t ransfer on nitrocellulose sheet revealed by another monoclonal anti-fibronectin ant ibody labelled with peroxidase.

Dr J-P. ALLAIN, C.N.T.S., avenue des Tropiques, B.P. 100 91943 LES ULIS, Cedex.

B I B L I O G R A P H I E

[1] DARMON M., BOTTENSTEIN J. and SATO G. - - Neural differenciation following culture of embryonal carcinoma cells in a serum free defined medium. Der Biol. , 85, 463, 1981.

134 ALLAIN J.P. et coll.

[2] ENGVALL E., RUOSLAHTI E. and MILLER E.ff. - - Affinity of f ibronect in to collagens of di f ferent genetic types and to f ibrinogen. ]. Exp. Med., 147, 1584, 1978.

[3] GANROT P .Q. - - Crossed immunoelec t rophores i s . Scand. J. Clin. Invest., 29, 7, 1972.

[4] LAURELL C.B. - - Quant i ta t ive es t ima t ion of p ro te ins by e lec t rophores is in agarose gel conta ining ant ibodies . Analyt. Biochem., 15, 45, 1966.

[5] MOSESSO~ M.W. and UMFLEET R.A. - - The cold-insoluble globulin of h u m a n p lasma. 1. Purif icat ion, p r i m a r y charac te r iza t ion and rela- t ionship to f ibr inogens and o the r cold-insoluble f rac t ion components . J. Biol. Chem., 245, 5728, 1970.

[6] MOSHER D.F. - - Action of f ibr in-stabi l izing fac tor on cold-insoluble globul in and ~2-macroglobnlin ill c lot t ing plasma. J. Biol. Chem., 2M, 1639, 1976.

[7] MOSHER D.F. and WILLIAMS E.M. - - F ibronec t in concent ra t ion is decreased in p l a s m a of severely ill pa t ien ts wi th d i s semina ted intra- vascular coagulat ion. J. Lab. Clin. Med., 91, 729, 1978.

[8] PROCTOR R.A., PRENDERGAST E. a n d MOSHER D.F. - - Fibronec t in media tes a t t a chmen t of s taphylococcus aureus to h u m a n neutrophi ls . Blood, 59, 681, 1982.

[9] SABA T.M., BLUMENSTOCK F.A., SCOVILL W.A. a n d BERNARD H. - - Cryopreci- p i ta te reversa l of opsonic a2-surface b inding glycoprote in deficiency in sept ic surgical and t r a u m a pat ients . Science, 201, 622, 1978.

[10] VUENTO M. and VAHERI A. - - Pur i f ica t ion of f ibronect in f rom h u m a n p l a sma by aff ini ty ch roma tog raphy under non-denatur ing condit ions. Biochem. Y., 183, 331, 1979.