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mmuno-analyse et biologie spécialisée (2011) 26, 176—181

EVUES GÉNÉRALES ET ANALYSES PROSPECTIVES

uel est l’intérêt de la recherche des anticorpsnti-nucléolaires dans la sclérodermie systémique ?hat is the interest of the detection of antinucleolar autoantibodies in

he systemic scleroderma ?

. Comacle, M. Padelli, Y. Renaudineau, P. Youinou ∗

aboratoire d’immunologie, hôpital Morvan, CHU de Brest, BP 824, 29609 Brest cedex, France

ecu le 4 mai 2011 ; accepté le 2 juin 2011isponible sur Internet le 22 juillet 2011

KEYWORDSScleroderma;Antinucleolarantibodies;Anti-Scl70;Anti-PM/Scl

Summary Detected by indirect immunofluorescence, antinucleolar autoantibodies (ANoA)constitute a heterogeneous group of autoantibodies, found in various autoimmune diseases.To assess their importance and clinical interest, we have selected 200 patients with positiveANoA detected between 2007 and 2010. ANoA represent 2.1% of the antinuclear antibodiesconducted in the laboratory. ANoA are detected, half in autoimmune diseases (systemic sclero-derma [SSc], lupus, rheumatoid arthritis. . .), and half in other diseases: thrombosis, transplant,cancer. . . ANoA are rarely indicative of SSc (8,8%) unless they fulfill the following conditions: anelevated titer (> 1/1280), a nucleolar homogeneous staining, and an associated speckled nucleusstaining. Such criteria are indicative of anti-PM/Scl or anti-Scl70, two ScS specific autoAb.© 2011 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.

MOTS CLÉSSclérodermie ;Auto-anticorpsanti-nucléolaires ;Anti-Scl70 ;Anti-PM/Scl

Résumé Détectés par immunofluorescence indirecte, les autoanticorps (autoAc) anti-nucléolaires (AANuc) forment un groupe hétérogène d’autoAc retrouvés dans différentesmaladies auto-immunes. Afin d’en évaluer l’importance et l’intérêt clinique, nous avons reprisde facon rétrospective 200 malades chez qui des AANuc avaient été mis en évidence entre2007 et 2010. Les AANuc représentent 2,1 % des recherches d’autoAc anti-nucléaires réaliséespar le laboratoire. Les AANuc ont été retrouvés, pour moitié dans des maladies auto-immunes(sclérodermie systémique [ScS], lupus, polyarthrite rhumatoïde. . .) et pour moitié dans d’autres

pathologies telles que des thromboses, des greffes, des cancers. . . Les AANuc sont rarementrévélateurs d’une ScS (8,8 %) sauf s’ils remplissent les critères suivants : un titre élevé d’AANuc(> 1/1280e), une fluorescence homogène du nucléole, et une fluorescence moucheté du noyau.Ces critères sont révélateurs d’ad’une ScS.© 2011 Elsevier Masson SAS. Tou

∗ Auteur correspondant.Adresse e-mail : youinou@univ-brest.fr (P. Youinou).

923-2532/$ – see front matter © 2011 Elsevier Masson SAS. Tous droits roi:10.1016/j.immbio.2011.06.003

utoAc anti-PM/Scl ou d’anti-Scl70, deux marqueurs spécifiques

s droits réservés.

éservés.

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Recherche des anticorps anti-nucléolaires dans la scléroderm

Introduction

Entre autres maladies auto-immunes non spécifiquesd’organe, la sclérodermie systémique (ScS) touche priori-tairement les femmes âgées de 45 à 60 ans. Sa prévalenceoscille en fonction de la localisation géographique entretrois et 24 pour 100 000 habitants [1]. Cette maladie estcaractérisée par une sclérose qui associe des anomaliesmicrocirculatoires et des phénomènes de fibroses. Classi-quement, la sclérose débute aux extrémités, s’étend auniveau de la peau avant de gagner les viscères. Ce sont lesatteintes viscérales à l’origine d’une pneumopathie intersti-tielle, d’une insuffisance rénale, d’une atteinte cardiaqueou d’une atteinte gastro-intestinale qui sont responsablesdes formes graves de ScS. Afin de tenir compte des diffé-rentes présentations cliniques de la ScS, on en distinguedeux formes. La première forme est cutanée, limitée, debon pronostic, et touche 60 % des malades. Cette forme estdominée par le syndrome de CREST (qui rend compte de laprésence d’une calcinose [C], d’un phénomène de Raynaud[R], d’une atteinte œsophagienne [E], d’une sclérodactylie[S] et de télangiectasies [T]). La seconde forme est cuta-née, diffuse, de pronostic moins favorable, et touche 40 %des malades. Une troisième forme, dite intermédiaire estparfois reconnue [2].

Le diagnostic de ScS repose sur des critères cliniques,morphologiques et biologiques. La biologie y joue un rôleimportant puisque la présence des auto-anticorps (autoAc)anti-centromère révèle un CREST dans 70 à 80 % des casalors que les autoAc anti-topo-isomérase I, ou anti-Scl70,sont retrouvés pour 30 % à des ScS cutanées diffuses [3].Enfin, pour 20 à 30 % de ces patients des autoAc dirigéscontre le nucléole des cellules sont retrouvés. Ces Acanti-nucléolaires (AANuc) ont été initialement associés auxScS mais ils sont actuellement négligés au prétexte qu’ilsmanquent de sensibilité [4]. Toutefois, la caractérisationdes cibles des AANuc associée au développement d’examensspécifiques a conféré à ces autoAc un regain d’intérêt [5].Nous nous proposons donc de faire le point sur la recherchedes AANuc à visée diagnostique et pronostique dans le cadred’une ScS.

Le nucléole

La fonction principale du nucléole est d’apporter à la celluleles ribosomes, un élément indispensable à la synthèse pro-téique. Différentes étapes sont nécessaires pour aboutir àla formation des deux sous-unités catalytiques du ribosome(Fig. 1). Premièrement, la transcription d’un pré-ARN ribo-somal (r) de 45S à partir de l’ADNr. Cette étape nécessitela coopération entre l’ARN polymérase (RNAP)-I et le fac-teur de transcription « nucleolar organising region » (NOR)90. Deuxièmement, le pré-ARNr s’associe avec différentesprotéines pour donner des complexes de ribonucléopro-téines (RNP). Ainsi, le complexe U3 sno-RNP qui comportepas moins de six protéines, dont la fibrillarine et une fractionU3 de 55 kd, est chargé de méthyler le pré-ARNr. Troi-

sièmement, les pré-ARNr méthylés sont ensuite découpésen trois fragments de 5,8S, 18S et 28S par les endonu-cléases To/Th ou Twa. Quatrièmement, l’ARNr 5S transcriten dehors du nucléole par la RNAP-III rentre dans le nucléole

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ystémique 177

our s’associer avec les ARNr 5,8S et 28S et former larosse sous-unité ribosomale. La petite sous-unité riboso-ale ne comprend que l’ARNr 18S. Cinquièmement, enfin,

l existe un système d’assemblage et de recyclage des ARNrui est assuré par le complexe PML/ScL et les protéines23/nucléophosmine et C23.

Chaque cellule compte dans son noyau plusieursucléoles dont la taille et le nombre dépendent du degré’activation de la cellule et de la phase du cycle cellu-aire. Les nucléoles disparaissent au cours de la mitose.e nucléole comporte trois zones, chacune est spécialiséeans une étape de la synthèse des ribosomes. Tout d’abordu centre on distingue une zone claire qui contient derandes boucles d’ADN qui renferment les gènes d’ADNr.ette organisation permet le regroupement des différentsènes d’ADNr, on en compte 150 à 200 organisés en amas etépartis sur cinq chromosomes et chez l’homme. Ensuite,n périphérie on retrouve une zone plus dense siège desrocessus de transcription des ARNr. Et enfin, toujours enériphérie on retrouve des zones granulaires chargées de’assemblage et de la maturation des pré-ribosomes. Laaturation finale des ribosomes s’effectue dans le cyto-lasme des cellules.

uto-anticorps anti-nucléolaires

révalence et spécificité

es AANuc existent chez 20 à 30 % des ScS [6]. L’état’activité des patients et la réponse au traitement sontans influence sur la positivité et le titre des AANuc. LesANuc apparaissent également dans d’autres pathologiesuto-immunes telles que le lupus érythémateux disséminéLED), le syndrome sec de Gougerot-Sjögren (SGS) et la poly-rthrite rhumatoïde (PR), voire au décours d’un cancer ouors d’une maladie du greffon contre l’hôte (GVHD) qui peutpparaître lors d’une greffe de moelle osseuse.

es cibles des Ac anti-nucléolaires dans la ScS

irtuellement tous les composants du nucléole peuvent êtrea cible des AANuc. Citons les Ac anti-PM/SCL, les Ac anti-3, les Ac anti-fibrillarine, et les Ac anti-ARNP de type I à IIIui sont spécifiques de la ScS (Tableau 1). Pour les Ac anti-OR90, les Ac anti-Th/To et les Ac anti-B23, l’intérêt estlus modéré car moins spécifique. Les Ac anti-Scl70 peuventtre rattachés au groupe des AANuc car la cible de cesutoAc, la topo-isomérase, est une protéine chargée de’organisation spatiale de l’ADN qui est présente dans leoyau et les nucléoles des cellules. Les AANuc représententonc un groupe hétérogène d’autoAc qui possèdent la singu-arité d’être mutuellement exclusifs et non retrouvés chezes témoins normaux.

En termes de prévalence, les Ac anti-ARNP I prédominentuisqu’ils sont retrouvés chez 8—20 % des ScS. Au niveaulinique, les Ac anti-ARNP I sont associés avec des formes dif-uses caractérisées par des atteintes rénales et cardiaques

ui peuvent être sévères voire fatales. Les Ac anti-U3 et lesc anti-fibrillarine, souvent associés, sont retrouvés pour 3 à% des patients dans des formes diffuses avec comme parti-ularité d’être mis en évidence chez des patients jeunes où

178 P. Comacle et al.

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St

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igure 1 Le nucléole est l’appareil de production des ribosomous les composants du nucléole peuvent être la cible des auto

rédomine une hypertension pulmonaire. Moins spécifiquest moins fréquents car retrouvés chez 2 et 5 % des cas decS, les Ac Th/To révèlent une forme intermédiaire qui vassocier un CREST avec une fibrose pulmonaire et/ou une

tteinte rénale. Enfin retrouvés chez seulement 2 % des ScSt 8 % des polymyosites, les Ac anti-PM/Scl révèlent pour0 % des patients une forme bénigne à la frontière entre la

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Tableau 1 Autoanticorps anti-nucléolaires et associations cliniqu

Cible Sclérodermie

Anti-ARN polymérase I Forme diffuse, rein et cœAnti-fibrillarine/anti-U3 Forme diffuse, poumonAnti-TH/TO Forme intermédiaire, pouAnti-PM/Scl Syndrome de chevauchemAnti-Nor 90 Forme limitée, syndromeAnti-Scl 70 Forme diffuse, poumon eAnti-B23/nucléophosmine Forme diffuse, poumon

LES : lupus érythémateux systémique ; PR : polyarthrite rhumatoïde.

nt la synthèse est très organisée et hiérarchisée. Virtuellement,orps anti-nucléolaires (AANuc).

cS et la polymyosite. Ce syndrome de chevauchement estrès sensible aux corticoïdes.

À côté des AANuc purs, certains AANuc peuvent êtressociés à une fluorescence du noyau ou du cytoplasme du

ait de la reconnaissance d’une cible commune. Citons troisxemples : les Ac anti-ADN, les Ac anti-Ro/SSa et Ac anti-a/SSB, et les Ac anti-ribosomes. L’ADN du nucléole peut

es.

Autres pathologies

ur RareRare

mon et rein Syndrome de Raynaud, LES, PR. . .

ent Rarede Raynaud LES, PR, cancers. . .

t cœur Rare (LES)LES, PR, cancers, médicaments

Recherche des anticorps anti-nucléolaires dans la sclérodermie systémique 179

Figure 2 Immunofluorescence indirecte sur cellules HEp-2 révélant différents aspects des autoanticorps anti-nucléolaires (AANuc)

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selon la spécificité des sérums.

être la cible des Ac anti-ADN et, dans ce cas, la fluorescencedu noyau sera associée avec un marquage à renforcementpériphérique du nucléole. En présence d’Ac anti-Ro/SSAet d’Ac anti-La/SSB, le noyau est moucheté tandis que lafluorescence du nucléole est faible et homogène. Enfin, enprésence d’Ac anti-ribosomes, la fluorescence sera cytoplas-mique et nucléolaire.

Recherche des Ac anti-nucléolaires sur cellulesHEp-2

Le dépistage des AANuc est réalisé au moment de larecherche des Ac anti-nucléaires (AAN) et concerne 2 à 5 %des sérums testés en routine sur cellules HEp-2 [7]. La lignéecellulaire humaine HEp-2, obtenue à partir d’un carcinomede larynx, présente l’avantage de disposer d’un noyau de

grande taille qui peut contenir jusqu’à cinq nucléoles faci-lement identifiables.

En pratique, la recherche des AAN et des AANuc sedécompose en plusieurs étapes. Tout d’abord, le sérum du

Adéc

atient est délicatement déposé sur des cellules HEp-2 quint été préalablement fixées et perméabilisées. La présencees AANuc est ensuite révélée par l’ajout d’une anti-lobuline couplée avec une molécule fluorescente telle que’isothiocyanate de fluorescéine (FITC). Enfin, l’appréciatione l’aspect de la fluorescence ainsi que le titrage du sérum’effectuent au moyen d’un microscope à fluorescence.e titre des AANuc est exprimé en inverse de dilutionvec un seuil de positivité fixé au 1/160e comme poures AAN.

Un œil averti est capable de distinguer trois types deuorescences nucléolaires (Fig. 2, Tableau 2). Tout d’abord,

e nucléole peut apparaître homogène de facon isolée (Acnti-Th/To et anti-B23/nucléophosmine), ou couplé avecne fluorescence mouchetée du noyau (anti-PM/Scl, anti-cl70). Ensuite, l’aspect du nucléole peut être mouchetét formé soit de grains fins et centrés s’il s’agit d’Ac anti-

RNP-I, soit de gros grains regroupés au centre s’il s’agit’Ac anti-fibrillarine et/ou d’Ac anti-U3. Enfin, la mise envidence de deux à cinq gros spots ou « dots » dans la zonelaire du nucléole est caractéristique des Ac anti-NOR90.

180 P. Comacle et al.

Tableau 2 Principaux autoanticorps anti-nucléolaires (AANuc) [8].

Cible Sclérodermie Aspect des AANuc

Prévalence (%) Spécificité

Anti-TH/TO 4—10 Moyenne HomogèneAnti-B23/nucléophosmine 10 Moyenne HomogèneAnti-PM/Scl 5 Forte HomogèneAnti-Scl 70 4—30 Forte HomogèneAnti-ARN polymérase 8—20 Forte MouchetéAnti-fibrillarine 3—83—8 Forte MouchetéAnti-U3 3—8 Forte MouchetéAnti-Nor 90 2 Faible 2—5 spots

Tableau 3 Anticorps anti-nucléolaires (AANuc) et pathologies associées retrouvés au CHU de Brest entre 2007 et 2010.

Pathologies n = 113 AANuc ≥ 1/1280e AAN moucheté

Sclérodermie 10 6 (60 %) 9 (90 %)Autres maladies auto-immunes 38 8 (21 %) 9 (23,7 %)Thromboses et AVC 13 2 (15,4 %) 4 (30,8 %)Greffe et GVHD 7 0 2 (28,6 %)Maladies inflammatoires 9 2 (22,2 %) 3 (33,3 %)Divers 36 6 (16,7 %) 7 (19,4 %)

se.

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PrABts2pu

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(dd

AVC : accident vasculaire cérébral ; GVHD ; graft versus host disea

otons que lorsque la cellule est en mitose, le nucléole dis-araît et la fixation des AANuc peut s’observer au niveau dea plaque équatoriale de la chromatine en division.

n pratique

our vérifier le bien-fondé pratique de ces notions théo-iques, nous avons repris de facon rétrospective tous lesANuc mis en évidence dans le laboratoire du CHU derest pour les années 2007 à 2010. Ainsi avons-nous iden-ifié 200 malades qui présentaient des AANuc, soit 2,1 % des

érums adressés au laboratoire en quête d’AAN. Pour 132 sur00 (66,0 %) d’entre eux, les AANuc étaient isolés, alors queour 68 sur 200 (34,0 %) des patients, une association avecn AAN était rapportée. Pour 113 malades, outre l’examen

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Tableau 4 Anticorps anti-nucléolaires (AANuc) et sclérodermie.

Patient Âge Sexe AANuc aspect AANuc titre AAN

1 47a F Homogène 1/1280 Mou2 60a F Homogène 1/1280 Mou3 38a M Moucheté 1/320 Non4 57a F Homogène 1/160 Mou5 68a F Homogène 1/1280 Mou6 47a F Homogène 1/1280 Mou7 53a F Homogène 1/1280 Mou8 55a M Homogène 1/1280 Mou9 62a M Homogène 1/320 Mou

10 49a F Homogène 1/640 Mou

linique initial, nous disposions également des résultatsérologiques réalisés dans le cadre d’un bilan d’AAN posi-if à savoir des Ac anti ADN natifs, des Ac anti-histones,es Ac anti-centromères et des Ac anti-antigènes solublesRo/SSA, La/SSB, Sm, Sm-U1RNP, Scl70 et Jo-1). De plus,our ces patients une recherche d’Ac anti-PM/Scl et d’Acnti-Scl70 a également été réalisée par immunodot (Sclero-olysynthetase kit, Ingen).

Qu’observe-t-on ? Les ScS ne représentent que 10 sur 1138,8 %) des AANuc mis en évidence (Tableau 3). Cepen-ant, il est intéressant de noter que les ScS qui possèdentes AANuc présentent trois caractéristiques (Tableau 4).

remièrement, pour ces patients le titre des AANuc estlevé. En effet, un titre supérieur à 1/1280e est observéour six sur dix (60 %) ScS contre 19 sur 103 (18,4 %) poures autres patients (p < 0,01 avec un test exact de Fisher).

AutoAc spécifique Clinique

cheté PM/Scl Articulaire et pulmonairecheté PM/Scl Syndrome de chevauchement

— Syndrome de CRESTcheté Scl70 Syndrome sec et Raynaudcheté Scl70 Syndrome de CRESTcheté Scl70 Fibrose pulmonairecheté Scl70 Atteinte viscérale multiplecheté Scl70 Fibrose pulmonairecheté Scl70 Fibrose pulmonairecheté Scl70 Cutané et pulmonaire

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Recherche des anticorps anti-nucléolaires dans la scléroderm

Deuxièmement, un aspect homogène des AANuc. Troisiè-mement, une association avec un aspect moucheté desAAN (9/10 versus 25/103, p < 0,01). Ces caractéristiquess’expliquent par la mise en évidence d’Ac anti-PM/Scl oud’Ac anti-Scl70 pour neuf sur dix de ces patients. En d’autreterme, l’association AAN—AANuc homogène dont le titre estélevé doit faire évoquer des Ac anti-PM/Scl et des Ac anti-Scl70 ce qui présente un intérêt pronostique majeur pour lepatient. Aucun autre autoAc recherché dans le cadre d’unAAN positif n’a été mis en évidence dans le groupe despatients ScS.

Pour d’autres patients, les AANuc sont retrouvés dansdifférentes pathologies qu’elles soient auto-immunes (LED,PR, syndrome de Gougerot-Sjögren. . .), associés avec desthromboses ou des accidents vasculaires cérébraux, dans lecadre d’une GVHD associée à une greffe ou dans diversespathologies. Notons que les AANuc, retrouvés dans uncontexte non auto-immun, présentent un aspect moucheté,un titre faible (AAN ≤ 1/320e pour 39 sur 65) et qu’ilsne sont pas associés avec un AAN (54 sur 65). Aucuneprédominance saisonnière n’a été retrouvée dans notreétude.

En conclusion, l’identification des AANuc sur cel-lules HEp-2 présente peu d’intérêt en première inten-tion. Toutefois, devant une ScS cette identificationdevient justifiée puisqu’elle va permettre de prédire

l’évolution de la ScS. Enfin, notons qu’une seule déter-mination est suffisante puisque les taux demeurentconstants et que les différents AANuc sont mutuellementexclusifs.

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ystémique 181

éclaration d’intérêts

es auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d’intérêts enelation avec cet article.

emerciements

es auteurs remercient vivement Nelly Fromont pour la par-ie technique, ainsi que Simone Forest et Geneviève Michelour la dactylographie de cet article.

éférences

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