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Recherche dans le sang des anticorps précipitants envers

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Page 1: Recherche dans le sang des anticorps précipitants envers

ARTICLE ORIGINAL

Recherche dans le sang des anticorps précipitants envers Aspergillus fumigatus etextraits totaux de foin moisi chez des chevauxatteints du syndrome hémorragie pulmonaireinduit par l’effort° A. CHABCHOUB, ° F. LANDOLSI, ° N. SADFI, °° A. BOURATBINE et ° A. GHORBEL

° École Nationale de Médecine Vétérinaire, Sidi Thabet 2020, Tunisie - e-mail : [email protected]°° Institut Pasteur de Tunis, Tunis 1010, Tunisie

RÉSUMÉ

Le syndrome épistaxis du cheval de course induit des contre perfor-mances et limite souvent la carrière sportive de l'athlète. Son mécanisme estmal élucidé malgré de nombreux travaux consacrés. La composante immu-no-allergique a été évoquée. Les auteurs recherchent les anticorps précipi-tants, dirigés envers Aspergillus fumigatus (AF) et des extraits totaux defoin moisi (Fo. Moi.) par électrosynérèse sur membrane d'acétate de cellu-lose. Fo. Moi. a été obtenu selon la technique de Pepys, AF sont des anti-gènes commerciaux (Diagnostics Pasteur). Les malades, au nombre de 30,sont des chevaux de course présentant des épisodes d'épistaxis répétés aprèsl'effort. Le diagnostic a été réalisé sur la base des commémoratifs, de l'exa-men clinique associé systématiquement à une endoscopie. Les témoins, aunombre de 49, sont des chevaux sains participant à des courses dans lesmêmes conditions que les chevaux malades. Pour chaque sérum, un scoretotal a été attribué par antigène. Il tient compte de la qualité, de l'intensité etdu nombre des arcs de précipitation. Les scores nuls obtenus envers les 2 antigènes sont comparables chez les chevaux témoins et malades.Néanmoins les scores moyens positifs envers Fo.Moi présentent une diffé-rence significative entre les 2 lots : les chevaux à épistaxis présentent destaux (3,0 ± 1,6) statistiquement supérieurs aux témoins (1,6 ± 0,8). La répar-tition des scores Fo.Moi. en fonction de l'intensité de la réponse révèle queles chevaux à épistaxis ont plutôt une réponse fortement positive : 86 % desmalades ont un score supérieur à 2, alors que 55 % des chevaux témoins ontune réponse du type faiblement positive. Aucun cheval à épistaxis n'a réagienvers AF. Les phénomènes d'hypersensibilité du type III envers Fo. Moi.seraient l'une des causes intervenant dans l'installation de l'épistaxis du faitqu'on trouve plus de précipitines anti Fo. Moi. avec des réponses du typefortement positif.

MOTS-CLÉS : épistaxis - Aspergillus fumigatus - foinmoisi - sérologie - cheval de course.

SUMMARY

Research of anti-Aspergillus fumigatus and anti-moud precipitins in theserum of horses suffering from exercice induced epistaxis syndrom. ByA. CHABCHOUB, F. LANDOLSI, N. SADFI, A. BOURATBINE andA. GHORBEL.

Race horse's epistaxis syndrome induces bad performances and often res-tricts sportive career of athlete. Its etio-pathogenic mechanism is not wellelucidate in spite of a many works devoted. The immuno-allergic compenanthas been evoquated.

The authors search for the precipitant antibodies directed towardsAspergillus fumigatus (AF) and mouldy hay total extract (Fo. Moi) by elec-trocynaeresis on cellulose acetate membrane. Fo. Moi were obtained accor-ding to the Pepys technic, AF are commercial antigens (DiagnosticsPasteur). The diseased horses, at the number of 30, were racehorses that sho-wed recurrent episodes of epistaxis after exertion. The diagnosis was reali-sed on the basis of commemoratives and clinical examination associated,systematically, to endoscopic examination. The control horses, at the num-ber of 49, are healthy horses taking part at the races in the conditions thandiseased horses. For each serum, a total score was attribuate to each antigen,taking into account the quality, the intensity and the number of precipitationarcs. The nil scores obtained toward the two antigens are comparable inhealthy and diseased horses. Neverless the mean positive scores toward Fo.Moi show a significant difference between the 2 groups : horses with epis-taxis show a mean level, 3.0 ± 1.6, statically higher than those of controlhorses, 1.6 ± 0.8. The distribution of Fo.Moi scores according to responseintensity reveal that horses with epistaxis have rather greatly positive res-ponses, in fact 86 % of diseased horses have a score higher than a weaklypositive type of responses. No horse with epistaxis, had reacted to AF. Thetype III hypersensitivity's phenomenons, toward Fo. Moi, could be one ofcauses intervening in fitting out of epistaxis because we find more precipitinanti-Fo Moi with a greatly positive type of responses.

KEY-WORDS : epistaxis - Aspergillus fumigatus - Mouldyhay - serology - racehorse.

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IntroductionLe syndrome hémorragie pulmonaire induit par l'effort

(HPIE) chez le cheval de course engendre des contre perfor-mances et limite souvent la carrière sportive de l'athlète. Sonmécanisme est mal élucidé malgré de nombreux travauxconsacrés.

En effet des séquelles de viroses respiratoires ont été incri-minées, néanmoins peu de virus furent effectivement isoléschez les chevaux atteints [1, 34]. L'hémiparésie laryngée aété mise en cause par COOK [10]. Cependant aucune étudeépidémiologique n'a confirmé cette supposition. De plusPASCOE et RAPHEL [35] rapportent qu'il n'y a pas de cor-rélation entre les anomalies des voies respiratoires supé-rieures et l'HPIE. Des troubles d'hémostase notamment lathrombocytopénie [6, 15, 22] et la diminution de l'agrégationplaquettaire [21], ont été évoquées. Ces perturbations ne sontpas retrouvées par CLARKE [8] et HOLM et coll. [21]. Deplus elles ne seraient pas importantes au point d'induire l'ap-parition spontanée d'hémorragie surtout que les saignementsne sont observés qu'au niveau du poumon [1]. L'hyper-tension artérielle [23], des troubles du rythme cardiaque [11,24] ont été évoqués. Cependant, aucun symptôme d'œdèmepulmonaire et de détresse respiratoire associée ne précèdel'hémorragie pulmonaire [36].

Les bronchiolites ont été mises en évidence dans les pou-mons des chevaux atteints de l'HPIE [28, 34]. De ce fait lesbroncho-pneumopathies obstructives chroniques (BPOC)seraient un facteur sous jacent à l'HPIE [8, 36, 38]. Le rôledes moisissures en tant que pneumoallergène a été démontrélors des BPOC du cheval [6, 18, 44] et de l'homme [33].

DERKSEN et coll. [12] ont même pu provoquer expéri-mentalement sur des poneys des hémorragies pulmonairesaprès exposition à un allergène (ovalbumine).

A notre connaissance aucune étude n'a recherché les préci-pitines envers des pneumoallergènes sur des chevaux à HPIE.

Il nous a semblé intéressant d'effectuer des recherches surle sang circulant, de précipitines envers Aspergillus fumi-gatus (AF.) et extraits totaux de foin moisi (Fo. Moi.) sur deschevaux à HPIE comparativement à des chevaux témoins etd’effectuer parallèlement une analyse mycologique du foinconsommé par ces mêmes chevaux afin d'essayer de dégagerl'impact de la composante immuno-allergique dans le syn-drome HPIE du cheval de sport.

1. Matériel et méthode

A) ANIMAUXLes témoins, au nombre de 49, sont âgés de 4,95 ± 1.22

ans. Ce sont des chevaux sains participant à des courses dansles mêmes conditions que les chevaux malades. Ce sont desanimaux sans antécédent d'épistaxis ni de maladie récente etn'ayant pas reçu de médicament au cours des 3 semaines pré-cédant le prélèvement. De plus ces chevaux ont subi uneendoscopie et un lavage broncho-alvéolaire [17] qui n'ontrien révélé d'anormal.

Les chevaux malades sont au nombre de 30. Ils sont âgésde 5.28 ± 1.79 ans. Ce sont des chevaux de course ayant mon-tré des épisodes d'épistaxis répétés après l'effort. Ces épi-sodes étaient répartis sur toute l'année.

Le diagnostic de l'HPIE a été réalisé sur la base des com-mémoratifs, de l'examen clinique et une endoscopie [17, 32]associés systématiquement à une analyse hématologique, uneexploration de l'hémostase [6] et d'un tracé électrocardiogra-phique [24].

B) MÉTHODES1) Dosage des précipitines

Le sérum a été obtenu à partir d'un prélèvement de 10 ml desang veineux dans un tube sec. Après coagulation, le sérum aété séparé par centrifugation (3000 g pendant 5 min) puiscongelé à -20°C jusqu'au moment de l'analyse. Pour cesrecherches, deux antigènes ont été utilisés. Il s’agit d’Asper-gillus fumigatus (A.F.) (Somatique et Métabolique) et desExtraits totaux de foin moisi (Fo.Moi.).

Les premiers antigènes (A.F.) sont des antigènes commer-ciaux, fournis par Sanofi Diagnostics Pasteur (Marnes laCoquette, France). Quant aux extraits totaux de foin moisi, ilsont été obtenus à partir du foin moisi de la région de Tunis etpréparés selon la technique de Pepys [5, 44].

Nous avons alors appliqué l'électrosynèrèse sur membraned'acétate de cellulose [5].

La lecture a été réalisée sur négatoscope après séchage àl'air libre (pendant 24 heures). Pour chaque antigène, la qua-lité, l’intensité et le nombre d’arcs ont été appréciés et gradéscomme suit :

absence d'arc 0

présence de traces 1

arc d’intensité moyenne 2

arc très intense 3

plusieurs arcs 4

Une estimation globale de positivité (Score total) a étéensuite attribuée à chaque sérum en additionnant les scoresobtenus par chaque antigène [5].

Toutes ces réactions ont été réalisées au laboratoired'Immunologie de l'Institut Pasteur de Tunis.

2) Analyse mycologique du foin

Le foin moisi, prélevé de la litière des écuries où vivaientles chevaux étudiés, a été dilacéré en fins morceaux, puisensemencé sur milieu de Sabouraud sans actidione (3 tubes)et milieu gélosé de Czapeck (3 tubes). L'incubation des cul-tures a été réalisée à l'étuve à 25°C. L'examen régulier descultures a été entrepris tous les 2 jours jusqu'à 10 jours.

L'identification des genres et des espèces des champignonsisolés a été basée sur la vitesse de croissance, l'aspect macro-scopique (aspect de la colonie, sa couleur, son revers et satexture) et l'aspect microscopique [42, 44].

3) Analyse statistique des résultats

Les différences entre les groupes ont été établies par un testparamétrique (test de Student) et par un test non paramé-

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trique (test de χ2). La différence a été considérée commesignificative au risque d'erreur de 5 %.

2. RésultatsIl n'existe pas de différence significative entre les malades

et les témoins en ce qui concerne la présence ou l'absenced'anticorps précipitants. Cependant si l'on ne s'intéressequ'aux chevaux qui ont des réponses positives, on remarqueque le score moyen positif des chevaux à HPIE obtenu enversFo.Moi. (3,0 ± 1,0) est statistiquement supérieur à celui destémoins (1,6 ± 0,8) (Figure 1). Le score moyen positif obtenuenvers AF ne présente pas de différence significative entretémoins et malades.

Pour Fo. Moi., le regroupement des réponses "faibles "score < 2 et des réponses "fortes" score ≥ 2, montrent que 86 % des malades ont des réponses "fortement" positives,mais ce pourcentage n'est que 45 % chez les témoins. La dif-férence est statistiquement significative. Toutes les réponsesobtenues envers AF sont du type faiblement positives et enplus aucun cheval à épistaxis n'a réagi envers AF.

La liste des champignons isolés à partir des cultures de foindurant les différents prélèvements est rapportée dans letableau I. C'est à la saison printanière qu'a été isolé le nombrele plus important d'espèces fongiques. Outre les espècesidentifiées, à partir de l'analyse mycologique d'échantillon defoin moisi, l'examen directe au microscope nous a aussi mon-tré la présence d'espèces d'acariens durant les saisons printa-nière et hivernale. Les espèces d'acariens isolés n'ont pas étéidentifiées.

3. DiscussionNotre étude s’est déroulée sur deux groupes comparables

concernant le lieu d’origine, l'âge, le sexe et la période d’exa-men.

La méthode d’analyse des anticorps précipitants est l'élec-trosynerèse. Celle-ci présente une amélioration par rapport àl’immunodiffusion double [33].

Nous avons noté que les chevaux HPIE avaient réagi à Fo.Moi. d'une manière plus intense que les chevaux témoinsavec des réponses du type fortement positif. Par analogie,nous rapportons les résultats obtenus dans deux de nos tra-vaux antérieurs en 1993 [5] et 1998 [6] réalisés sur des che-vaux à BPOC. Dans un premier travail nous avons noté quele score obtenu envers Fo. Moi était comparable chez lestémoins et malades, alors que dans le deuxième travail en1998, les chevaux à BPOC avaient un score envers Fo. Moistatistiquement supérieur à celui des témoins.

Ces résultats rejoignent ceux de GUELFI et coll. [18] qui,par un test de diffusion sur gélose selon la méthoded'Ouchterlony, trouvent chez des chevaux à BPOC plus deprécipitines anti-extraits totaux de Fo. Moi que chez lestémoins. On s'accorderait à prêter à l'existence de ces préci-pitines un rôle probable dans l'immunopathologie de cesaffections et plus précisément ces anticorps seraient associésaux phénomène d'Arthus (HS III) [18].

Il pourrait ne s’agir que d’une réaction non spécifiquereflétant un contact des chevaux avec du foin sans aucunerépercussion pathologique. FRANQUEVILLE et coll. [16]

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FIGURE 1. — Comparaison des scores des précipitines obtenus chez les chevaux témoins et les chevaux à hémorragie pulmonaire induite par l’effort.

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en 1990 décrivent le cas d'un cheval qui développe une“allergie” à une paille d'excellente qualité, le test cutané à lapaille vierge fut très positif. HALLIWELL et coll. [19] trou-vent, par ailleurs, que l'extrait de soja donne plus de réactionspositives en intra-dermo réaction chez des chevaux témoinsque chez des malades. ERIKSON [14] en utilisant l’intra-dermo réaction, trouve plus de réactions positives dirigéescontre Fo. Moi. que contre A.F. Dans ce même ordre d’idée,HALLIWELL et coll. [19] utilisant la même technique rap-portent que des chevaux témoins et atteints de BPOC ontréagi plus aux Fo. Moi. qu’à A.F. TERRAIL et coll.[43] rap-portent que chez l’homme atteint d’une forme récente dusyndrome du poumon de fermier le nombre de réactions posi-tives est plus important pour Fo. Moi. que pour Faeni recti-vurgula. Pour MOLINA [33], ces précipitines peuvent êtreobservées sur des sujets exposés au foin et ne présentant pasde maladie.

Pour A.F., et comme nous l'avons remarqué dans des tra-vaux antérieurs réalisés sur des chevaux à BPOC [6, 7], nousn’avons pas trouvé de différences significatives entretémoins et malades. Ceci rejoint les conclusions d’AS-MUNDSSON et coll. [2] qui, utilisant l'immuno-diffusiondouble en gélose, trouvent sur 15 chevaux atteints d'“emphy-sème de foin”, 15 réactions positives pour Faeni rectivurgulacontre une seule pour A.F. De même GUELFI et coll. [18] etLAWSON et coll. [25] trouvent une part plus importantejouée par Faeni rectivirgula et une incidence beaucoup plusfaible pour A F.

Nénmoins, SCHMALLENBACH et coll. [40] trouventchez des chevaux atteints de bronchites chroniques desniveaux d'IgE et IgG somatiques dirigées contre l'antigèneA.F. dans le liquide de lavage bronchoalvéolaire (LBA)significativement plus élevés que chez les témoins alors queles niveaux sériques ne sont pas en corrélation. Ces auteurssuggèrent que ces allergènes sont impliqués dans l'inductiondes IgE et IgG dans les voies aériennes et peuvent, potentiel-lement, être utilisés comme biomarqueurs des exacerbationsdes bronchites chroniques en rapport avec A.F.

EDER et coll. [13] rapportent de leur coté que les chevauxatteints de bronchites chroniques sont plus sensibilisés auxallergènes recombinants d'A.F. et d'Alternaria que les che-vaux témoins alors que les réponses sont comparables s'ilsutilisent comme allergènes des extraits bruts d'A.F.

Nous avons trouvé [7], sur des chevaux à BPOC, que lemaximum de réponses positives survient envers A.F princi-palement en automne [7]. L'incidence de ce type de réponseserait en relation avec les conditions du développement duchampignon. Néanmoins, chez les chevaux à épistaxis nousn'avons pas noté de variation saisonnière vu que l'affection aété constatée de manière indifférente pendant toute l'année.

L'analyse mycologique que nous avons réalisée sur le foinmoisi montre que celui-ci contient une mosaïque de moisis-sures. Celles que nous avons isolées, étaient en premier lieuAspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Aspergillus nidu-lans, Aspergillus flavus. Le genre Aspergillus est très connuen matière d'allergie fongique, son rôle dans les accidentsallergiques respiratoires est certain [37], en particulier chezl'homme [33], le cheval [7, 29] et les volailles [20]. La fré-quence pathologique d'Aspergillus fumigatus est expliquéepar le fait que ce champignon est ubiquitaire. Sa large diffu-sion dans l'air ambiant, en particulier les box poussiéreux deschevaux, entraînerait une contamination de leur voies respi-ratoires [20]. Les foins constitueraient le principal vecteurd'Aspergillus fumigatus. Cette espèce se développe principa-lement dans des foins récoltés avec moins de 30 % d'humi-dité [26]. Aspergillus flavus est caractérisé par une pathogé-nicité moins grande qu'A.F., celles des autres espècesd'Aspergillus demeure incertaine [37].

Bien que présent dans le foin moisi récolté, et contraire-ment à nos travaux antérieurs sur des chevaux à BPOC [5],nos résultats ne montrent pas de différence significative entretémoins et chevaux à HPIE en ce qui concerne Aspergillusfumigatus. En effet, aucun malade et un petit pourcentage detémoins avaient une réponse positive, celle-ci pourrait nerefléter qu'une réaction non spécifique traduisant un contact

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TABLEAU I. — Champignons isolés à partir du foin moisi.

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des animaux avec l'antigène sans avoir de répercussionspathologiques. Le fait de la rencontrer sur les chevaux lesplus âgés serait en faveur de cette supposition [18]. De plus,les scores totaux obtenus étaient faibles par rapport à ceux dufoin moisi. Ceci pourrait être expliqué par les conditions del'environnement, en particulier celles du climat qui n'étaientpas favorables au développement d'Aspergillus fumigatusdont la sporulation nécessite moins de 30 % d'humidité et unetempérature élevée dépassant les 30°C [26].

Penicillium, Alternaria, Rhizopus, Fusarium, Mucor,Acremonium, Trichoderma, Sepedonium et Scopulariopsisont été aussi isolés à partir de nos examens d'échantillons defoin moisi. Le rôle de ces microrganismes en tant que pneu-mallergènes n'a pas été jusqu'à présent démontré [9].D'ailleurs ASMUNDSSON et coll. [2] avaient obtenu chezun groupe de 15 chevaux atteint d'emphysème de foin, uneseule réponse positive envers Rhizopus, et les chevaux furenttous négatifs à Penicillium et Alternaria.

Les actinomycètes thermophiles présents dans du foin malconservé [5, 20] dont le plus important, car le plus antigè-nique, est Faeni rectivirgula, n'ont pas été recherchés danscette présente étude. Celui-ci est responsable d'une hypersen-sibilité de type III chez le cheval [5, 18, 19, 29, 31] et de lamaladie de poumon de fermier de l'homme [33].

Telle que l'ont noté d'autres auteurs [18, 26, 29, 41], laréponse des équidés variait avec l'écosystème des champi-gnons qui est fortement lié aux conditions du milieu.

ConclusionIl ressort de ces résultats qu'une prévalence de précipitine

anti-foin moisi a été notée chez les chevaux atteints d'HPIE.Ce foin contient une mosaïque de moisissures et acarienspotentiellement pathogènes. La signification exacte n'estpas bien élucidée mais on s'accorderait à donner à l'hyper-sensibilité de type III un rôle probable dans la genèse desBPOC. Mais ceci infirme t-il une relation entre ces BPOC etHPIE.?

ART et LEKEUX [1] considèrent que toutes les sub-obs-tructions des voies aériennes supérieures et profondes sontdes facteurs aggravants de l'HPIE. Néanmoins la prévalencede l'HPIE est importante même dans les pays où les maladiesobstructives (BPOC) sont rares (telle que la NouvelleZélande) [10]. De plus il n'existe pas de corrélation entre laprésence de matériel mucopurulent au niveau de la trachée,pathognomoniques de BPOC [4, 30], et l'existence de HPIE[3, 27]. La distribution des lésions dans la région dorso-cau-dale chez les animaux à HPIE ne se retrouvent pas dans lesmaladies pulmonaires chroniques ou sub-chroniques [9].

L'effort et l'importance de la dilatation pulmonaire chez lecheval entraîne des conditions susceptibles de révéler deslésions minimes dues à ces affections. Le bronchospasmeserait responsable des ruptures des capillaires alvéolaires etbronchiolaires. Ce bronchospasme pourrait être provoqué parun réflexe vagal probablement à partir d'une hyperréactiondes récepteurs des voies respiratoires due à l'augmentation dudébit ventilatoire ou à la distension du poumon.

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