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Zeitschrift fur Allg. Mikrobiologie 13 3 1973 193- 198 (Laboratoire de Recherches de la Chaire de G6n6tique, Ecole Nationale Sup6rieure Agrono- mique, Centre de Recherches Agronomique de Montpellier, Institut National de la Recherche Agronomique, Montpellier, France) Remarques sur le m6tabolisme respiratoire de Khyveromyces frugdis VAN DER WALT ALINECHASSANG-DOUILLET, J. LADET, H~L&NE BOZE et P. GALZY (Eingegangen a m 12.6.1972) Le m6tabolisme respiratoire deKEuyveronzyces fragilis pr6sente des differences importantes avec celui de Saccharomyces cerevisiae. L’effect glucose qui est tr&s important chez 8. cerevisiae (EPHRUSSI 1966) est inexistant chez les Kluyveromyces. La concentration en glucose n’a pratiquement pas d’influence sur l’activitk respiratoire. Le m6tabolisme fermentaire des Kluyveromyces est moins actif que celui des Saccharo- myces. I1 est sensible tt l’action inhibitrice de l’air. Cependant l’effet Pasteur est moins important que chez S. cerevisiae. Le mbtabolisme respiratoire est gbnbralement plus actif que le metabolisme fermentaire (QgQ chez les Kluyveromyces. Les Kluyveromyces sont utilisbs depuis quelques annkes pour la fabrication industrielle de levures aliments (Fromageries BEL - Vendome). Les procedks industriels mis en oeuvre avec ces levures sont voisins de ceux employks tradi- tionellement dans le cas des Saccharomyces. Or, les mkcanismes regulateurs du mbtabolisme respiratoire ne sont pas nkcessairement les mgmes dans les deux cas. D’autre part, la separation des genres Saccharomyces et Kluyveromyces B la suite des travaux de VAN DER WALT (1970), est essentiellement baske sup des critbres morphologiques. I1 n’est donc pas inutile de comparer la physiologie des levures appartenant Cette premiere note a pour but de dkcrire quelques particularit& du mkta- bolisme respiratoire des Kluyveromyces. ces deux groupes. Matiriel et mdthodes Matkriel biologique: Une souche de Kluyveromyces fragdis VAN DER WALT appelke SG 1 a kt6 utiliske. Techniques de culture: Toutes les cultures sont faites en milieu liquide et agitees (80 oscil- lations/mn; amplitude 8 cm) en erlenmeyers de 3 1 contenant 500 ml de milieu. La tem- perature eat de 25 “C. Le milieu utilis6 est du yeast nitrogen base DIFCO 0,67% additionnb de glucose ou de lactose aux concentrations de 0,2, 0,8 et 2%. La croissance est suivie par comptage hematim6trique. Des prelevements sont effectuhs aux divers stades de celle-ci. AprBs centrifugations et lavages au moyen de phosphate monopotassique ~/15, pH 4,5, les cellules sont utilisees pour les determinations mano- mbtriques. 13*

Remarques sur le métabolisme respiratoire de Kluyveromyces fragilis Van Der Walt

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Page 1: Remarques sur le métabolisme respiratoire de Kluyveromyces fragilis Van Der Walt

Zeitschrift fur Allg. Mikrobiologie 13 3 1973 193- 198

(Laboratoire de Recherches de la Chaire de G6n6tique, Ecole Nationale Sup6rieure Agrono- mique, Centre de Recherches Agronomique de Montpellier, Institut National de la Recherche

Agronomique, Montpellier, France)

Remarques sur le m6tabolisme respiratoire de Khyveromyces frugdis VAN DER WALT

ALINE CHASSANG-DOUILLET, J. LADET, H ~ L & N E BOZE et P. GALZY

(Eingegangen a m 12.6.1972)

Le m6tabolisme respiratoire deKEuyveronzyces fragilis pr6sente des differences importantes avec celui de Saccharomyces cerevisiae. L’effect glucose qui est tr&s important chez 8. cerevisiae (EPHRUSSI 1966) est inexistant chez les Kluyveromyces. La concentration en glucose n’a pratiquement pas d’influence sur l’activitk respiratoire.

Le m6tabolisme fermentaire des Kluyveromyces est moins actif que celui des Saccharo- myces. I1 est sensible tt l’action inhibitrice de l’air. Cependant l’effet Pasteur est moins important que chez S. cerevisiae.

Le mbtabolisme respiratoire est gbnbralement plus actif que le metabolisme fermentaire (QgQ chez les Kluyveromyces.

Les Kluyveromyces sont utilisbs depuis quelques annkes pour la fabrication industrielle de levures aliments (Fromageries BEL - Vendome). Les procedks industriels mis en oeuvre avec ces levures sont voisins de ceux employks tradi- tionellement dans le cas des Saccharomyces. Or, les mkcanismes regulateurs du mbtabolisme respiratoire ne sont pas nkcessairement les mgmes dans les deux cas.

D’autre part, la separation des genres Saccharomyces et Kluyveromyces B la suite des travaux de VAN DER WALT (1970), est essentiellement baske sup des critbres morphologiques. I1 n’est donc pas inutile de comparer la physiologie des levures appartenant

Cette premiere note a pour but de dkcrire quelques particularit& du mkta- bolisme respiratoire des Kluyveromyces.

ces deux groupes.

Matiriel et mdthodes Matkriel biologique: Une souche de Kluyveromyces fragdis VAN DER WALT appelke SG 1

a kt6 utiliske. Techniques de culture: Toutes les cultures sont faites en milieu liquide et agitees (80 oscil-

lations/mn; amplitude 8 cm) en erlenmeyers de 3 1 contenant 500 ml de milieu. La tem- perature eat de 25 “C.

Le milieu utilis6 est du yeast nitrogen base DIFCO 0,67% additionnb de glucose ou de lactose aux concentrations de 0,2, 0,8 et 2%.

La croissance est suivie par comptage hematim6trique. Des prelevements sont effectuhs aux divers stades de celle-ci. AprBs centrifugations et lavages au moyen de phosphate monopotassique ~ / 1 5 , pH 4,5, les cellules sont utilisees pour les determinations mano- mbtriques.

13*

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194 ALINE CHASSANG-DOUILLET, J. LAUET, H ~ L E N E BOZE et P. GALZY

Techniques manombtriques: Now avons utilid la mbthode directe de WARBURG. Les details experimentaux ant d&jA B t B deerits (GALZY 1964). Rappelons que toutes Ies valeurs donnees sont ramenees it I’heure et au mg de matitre stche.

Les proteines sont dosees par la reaction du biuret selon STRICKLAND (1951). La correspondance proteines, matitre stche, nombre de cellules, a b tb determinee exhi -

mentalement. Elle est differents suivant que le substrat de croissance est le glucose 011 le lactose.

RCsuEtats et discussicn

Cellules cu l t i vees s u r glucose

L’activiti: respiratoire de cellules prelevees en phase exponentielle de crois- sance sur glucose 0,2% est testee sur ce m6me substrat dans l’appareil de WAR- BURG. Les Qo, glucose sont 8levi:s: 110 i 190.

La vitesse d’oxydation du glucose est plus faible chez les cellules prelevees en phase de ralentissement (Qo, glucose = 30).

Le graphique IAillustre ces rbsultats. La vitesse de fermentation du glucose sous atmosphere d’azote (Q:& glucose: 130 B 160) est lltgerement plus faible que la vitesse de respiration dans le cas des cellules prelevkes en croissance exponen- tielle. Cette vitesse dhcroit hgalement pour les cellules prelevees en fin de culture (Qc& glucose = 30). N

La fermentation en presence d’air est particulibrement faible. Le Qi& fermentaire glucose est de 25 pour les cellules prblevees en phase ex-

ponentielle. I1 est de 15 pour les cellules prelevees en phase de ralentissement (graphique IA) .

Kluyveromyces fragilis presente donc un metabolisme fermentaire moins actif que celui des Xaccharomyces. Le mbtabolisme respiratoire est nettement domi- nant. L’effet Pasteur est trhs important et ritduit considerablement le mbta- bolisme fermentaire en presence d’air. Enfin, il faut noter que l’activite respira- toire est maximale pendant la phase de croissance exponentielle alors qu’elle est, b ce m6me stade, minimale chez Saccharomyces cerevisiae. Ce resultat suggere que l’effet glucose pourrait &re inexistant chez les Kluyveromyces.

Ces mi5mcs cellules respirent plus faiblement le galactose que le glucose (gra- phique IB) : le Qo2 galactose varie de 70 h, 100 pour les cellules prelevees pendant la phase exponentielle. I1 est de 15 pour les cellules en fin de croissance. La fer- mentation du galactose est pratiquement nulle : Q& galactose et Q$? galactose sont tr&s voisins de zero.

La respiration du lactose est encore plus faible (graphique IC). Le Qo, lactose varie de 2 & 35. La fermentation du lactose est nulle.

Lorsque le milieu de culture contient 2% de glucose, la population atteint 250 millions de cellules/ml en fin de croissance au lieu de 90 mjllions/ml sur glucose 0,2%. En prbsence de glucose 0,8%, la population atteint environ 210 millions de cellules/ml. Sur milieu yeast nitrogen base Difco le glucose n’est plus le facteur limitant la croissance pour les concentrations supkrieures B 0,5 yo. Les metabolismes respiratoires et fermentaires des cellules sont sensiblement identiques en presence de O,S% et de 2% de glucose.

Nous ne discuterons donc que les resultats obtenus dans le cas des cellules cultivhes en presence de 2% de glucose.

La vitesse de respiration du glucose est encore plus &levee en phase exponen- tielle (Qo, glucose: 110 B 140) qu’en phase stationnaire (Qo, glucose = 25) (gra-

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Mhtabolisme respiratoire de Kluyveromyces

pl/h/mg M.S.

50

195

*pl/Nmg M.S.

= C -

...

Fig. 1

200

100

0

100

0

pl/h/rng M.S.

= A

200

100

w 5 0 xlO~ellules 0

100

\ A

0

6

100 200 x 106crlluIcs

.\ 100 200

phique IIA). L’activitb respiratoire est plus faible que l’activitb fermentaire en atmosphere d’azote: Q&, glucose: 160 B 220 en phase exponentielle et 80 en fin de culture.

Le Qg& fermentaire glucose reste faible (voisin de 30). Ces rBsultats montrent que l’effet glucose est pratiquement inexistant chez Kluyveromyces fragilis. La richesse du milieu en glucose modifie peu le niveau des mbtabolismes respira- toire et fermentaire de la cellule. Cependant, en presence de 0,8% et de 2% de glucose, le mktabolisme fermentaire sous azote est 1bgArement plus Blevb que le metabolisme respiratoire alors qu’on observe l’inverse chez les cellules

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196 ALINE CHASSANO-DOUILLET, J. LADET, H ~ L ~ N E Bozx et P. GALZY

200

100

0

100

0

100

0

\ =A 1 100 A A+ 100 x106cell"lscO

m 1 ' 100

100

0

100

0

pl /h/rng M.S.

=A

- I

100 200 300 x 106cellu~es

- z

100 200 300

=C

.,A \ ,

100 200 500

Fig. 2. Evolution des parambtres mbtaboliques au cours de la croissance sur lactose 0,2% (111) ou lactose 2% (IV).

Mesures en presence du glucose (A), galactose (B), lactose (C); Q O ~ , QE& fermentaire, A Q&

cultiv6es sur glucose 0,2 yo. Le mbtabolisme respiratoire est 16ghement plus faible et le mbtabolisme fermentaire 16ghement plus 6levB.

Le galactose est respire par les cellules cultiv6es sur glucose 2% (graphique IIB) : Qo, galactose 80 P 100. Le mbtabolisme fermentaire est par contre presque nu1 .

Le lactose n'est ni respir6, ni ferment6 par les cellules cultivkes sup glucose 0,8 ou 2% (graphique IIC).

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MCtabolisme respiratoire de Kluyveromyces 197

Cellules cu l t iv6es su r l ac tose Au coups de la croissance en presence de lactose 0,2%, l’activite du metabo-

lisme respiratoire diminue constamment. Les vitesses d’oxydation sont com- parables pour le glucose (Qo, glucose : 220 B 50), pour le galactose (Qo, galactose : 200 B 70) et pour le lactose (Qo, lactose: 180 B 50) (graphiques I I IA, B et C). La culture sur lactose provoque donc l’induction de la biosynthese des enzymes responsables de l’oxydation du lactose et du galactose. I1 est d’ailleurs connu que les enzymes metabolisant le galactose sont adaptatifs (de ROBICHON-SZUL- MAJSTER 1960). I1 ne semble pas que le lactose soit plus favorable que le glucose B la biosynthese du systhme respiratoire gen6ral.

Une induction par le lactose des enzymes responsables de la fermentation du lactose et du galactose est aussi observee. Les Qg& glucose (40 B 80), Q& ga- lactose (10 B 50) et Q& lactose (20 B 70) sont assez voisins. Les &$A, fermen- taires sont toujours trAs faibles. I1 est curieux de noter que le metabolisme fermentaire du glucose est nettement plus faible chez les cellules cultivees sur lactose (Q:& glucose: 40 A, 80) que chez les cellules cultivees sur glucose (&;A, glucose: 130 B 160). Certains enzymes responsables de la fermentation du glu- cose pourraient &re en partie inductibles, bien que toujours presents.

Sur milieu yeast nitrogen base Difco, le lactose constitue le facteur limitant la croissance jusqu’k 0,5y0. Les populations en fin de culture sont de 150 millions de cellules/ml en presence de 0,2% de lactose, et de 360 millions de cellules/ml en rJresence de 2O/,. Les metabolismes fermentaire et respiratoire sont com- parables aprAs culture sur lactose 0,8yo et sup lactose 2./* (graphiques IV A, B et C).

Les mktabolismes respiratoire e t fermentaire sont actifs pendant la phase de croissance exponentielle et diminuent en fin de croissance. On n’observe pas de differences fondamentales entre les cultures sur lactose 2% et lactose 0,2y0.

E t u d e d e l ’effet P a s t e u r Pour exprimer l’effet Pasteur, nous avons calcule le coefficient suivant qui

mesure l’inhibition du mhtabolisme fermentaire en prbence d’air

Qt& fermentaire E P = 100 x

Q& Nous avons Bgalement calculk le quotient de PASTEUR-MEYERROF :

Q ~ A ~ - Q:;, fermentaire

00, Q M =

Ce coefficient mesure l‘inhibition du metabolisme fermentaire par le mbtabo- lisme respiratoire. Un coefficient Bgal B l’unite signifie que la respiration d’une molecule de glucose emphche la fermentation de 3 molixules de ce substrat.

Ces quotients ont 6th d’abord calcules en utilisant le glucose comme substrat dans les mesures effectuhes B l’appareil de WARBURG, Les r6sultats sont group& dans le tableau no 1 pour les cellules en croissance exponentielle. Le m6tabo- lisme fermentaire est fortement inhibe en presence d’air. Cette action est plus forte dans lea cultures sur glucose que dans les cultures sur lactose. Cela traduit

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198 ALINE CHASSANG-DOUILLET, J. LADET, HEL~NE BOZE et P. GALZY

84 = 0

6

Tableau 1 Etude de I’effet Pasteur

Cellules en croissance exponentielle cultivbes sur glucose ou lactose. Mesures en presence de glucose

7 0,34 0,11

3

Milieu de culture

17 0,23 0,12

7

E. P.

Q. M.

N

a E. P.

aQ. M.

0,2%

15 2

0,83 0,18

6

Glucose

0,8% 1 2% I

1.1 1! i 1.23 2:

32 11

0,24 0,12

7

Lactose

038% I 2%

0.22 0.34

Tableau 2 Etude de l’effet Pasteur.

galactose Cellules en phase exponentielle cultivbes sur lactose. Mesures en presence de lactose et

Substrat de mesure I Lactose Concentration en lactose

du milieu de culture 1 0,2% I

E. P.

Q. M.

N

a E. P.

a&. M.

peut &re simplement le fait que

23 10

0,24 0,03

3

2%

28 20

0,34 0,14

6

Galactose

mhtabolisme fermentaire est pluc

2% -~

44 29

0,28 0,21

6

Irt aprks culture sur glucose qu’apr8s culture sur lactose. D’aprks les valeurs du coeffi- cient E P, il ne semble pas que la concentration en substrat glucidique dans le milieu de culture modifie significativement la sensibilitb B l’air du mbtabolisme fermentaire. Le coefficient de PASTEUR-MEYERHOF est voisin de l’unitb chez les cellules cultivees sur glucose quelle que soit la concentration en substrat carbone. Rappelons que ce quotient est itgal B 2 ou 3 chez 8. cerevisiae (SLO- NIMSRI 1955). Cela revient B dire que la respiration d’une molecule de glucose empeche la fermentation de 6 B 9 molecules de glucose chez S. cerevisiae et seulement de 3 molbcules chez Kluyveromyces fragilis. L’effet Pasteur ainsi mesurb est donc moins fort chez les Kluyveromyces que chez les Saccharomyces. Ces resultats montrent que la regulation des mbtabolismes respiratoire et fer- mentaire est differente dans ces deux genres. Apres cultures sur lactose, les cellules prbsentent un quotient de PASTEUR-MEYERHOF tr&s faible (0,27) (ta- bleau no 1) et une inhibition (coefficient E P) moins forte.

L’effet Pasteur est donc ritduit chez les cellules cultivees sur lactose. Dans le cas des cellules prelevees en phase stationnaire, I’air inhibe moins

fortement le metabolisme fermentaire; le coefficicnt E P varie de 30 B 80. Les memes coefficients ont 6th calculhs en utilisant le lactose et le galactose

comme substrats. Ces mesures n’ont de signification qu’apr&s culture sur lactose (tableau no 2 ) . En effet, apres culture sur glucose, les fermentations du lactose et du galactose sont trks faibles ou nulles. L’air inhibe la fermentation du lac- tose et du galactose; mais la fermentation de ces substrats est moins sensible ii l’action de l’air que la fermentation du glucose d’aprks leu valeurs du coef- ficient E P. Le coefficient de PASTEUR-MEYERHOF est faible : 0,27 pour le lac- tose et 0,31 pour le galactose.

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Mbtabolisme respiratoire de Kluyveromyces 199

E t u d e d e l ’e f fec t glucose

Afin de confirmer que l’effet glucose n’existe pas chez Kluyveromyces nous avons tent6 d’estimer la vitesse de biosynthese des ”enzymes respiratoires” dans nos diverses conditions de culture. Nous avons, pour ce faire, effectub le produit de la quantitb de matiere seche contenue dans un ml de culture par l’activiti: respiratoire (Qo, glucose). Ce produit mesure, en premiere approxi- mation, la quantiti! des ”enzymes respiratoires“ dans la culture. Les variations de ce produit ont bt6 suivies pendant la croissance exponentielle : nous estimons ainsi la vitesse de biosynthese du systeme respiratoire responsable de l’oxydation du glucose dans nos cultures. Cette vitesse est indbpendante de la concentration en glucose dans le milieu de culture. De plus, nous avons vbrifib qu’elle est indbpendante de la concentration en lactose losque ce dernier est le substrat de croissance. Enfin, les vitesses sont voisines dans les cultures sur glucose et sur lactose.

Ces v6rifications confirment que l’effet glucose est nu1 chez les Kluyveromyces.

Ce travail a fait I’objet d’une aide de la Dbkgation Gbnbrale B la Recherche Scientifique e t Technique, contrat No 71-7-3137.

References EPHRUSSI, B. et al., 1956. Variations physiologiques et cytologiques de la levure au cours

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ROBICHON-SZULMAJSTER, H. DE, 1961. Contribution B 1’8tude gbnbtique e t physiologique du mbtabolisme du galactose chez la levure. These de Docteur Ingbnieur. Ann. Technol. Agric., 10, 81.

SLONIMSKI, P. P., 1955. Adaptation respiratoire : dbveloppement du syst6me hbmoprotbique induit Dar I’oxveGne. Proc. third internat. Congr. Biochem. Brussels. Academic Press Inc. Niw YorG,-p. 242.

STRICKLAND, L. H., 1951. The determination of small quantities of bacteria by means of

I

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Study, J. LODDER (Editor). North Holland Publ. GO., p. 316. VAN DER WALT, J. P., 1970. Kluyveromyces VAN DER WALT. In : The Yeasts, a Taxonomic

Adresse: Dr. ALIKE CHASSANO-DOUILLET Laboratoire de Recherches de la Chaire de Genet,ique, Ecole Nationale Superieur Agronomique, Institut National de la Recherche Agronomique 34 Montpellier, France