S]EPAI~ATION ET D O S A G E DE L ' A C I D E

A S C O t I B I Q U E ET DE L ' A C I D E

I S O A S C O I ~ B I Q U E

M:ME FROSA PAZARINCEVI(~ & M. ALEXANDR, E DAMANSKI

Inst i tut de Chimie de Technologie et de M6tallurgie B e l g r a d e - (Yougoslavie)

Si ces deux acides st6r6o-isom@res sont trSs semblables par leurs propri6t6s physico-chimiques, ils sont trSs diffSrents par leur action biochimique. L'acide D-isoascorbique se trouve rarement dans ]es produits naturels, mais dans certaines conditions, il peut 6tre synth6tis@ dana l'organisme. Ainsi, les t ravaux de KA~IY & NACABYASCHI sur Ia st@r@o-isom6risation de l'acide ascorbique par les bact6ries Micrococcus varians magula et Nocardia farcinica sont int@ressants. Au cours de ces reeherehes, il a r@ussi £ r6Miser l'inver- sion de la configuration de ]'aeide ascorbique et de ses produits de m6tabolisme. Ainsi se forment t'acide D-isoascorbique et l'aeide D-2-c6togulonique. Par la suite, TAKAHASCHI, MITSUNO & KAYA- MORI out obtenu l'acide arabo D-ascorbique de D-g]ucose-l-14C avec un rendement de 80% au moyen de diverses cultures de p6nicillium. En outre, il est connu que certaines bact6ries peuvent provoquer l'inversion de la configuration de l'acide LD-ascorbique en acide DL-ascorbique, qui eat l 'antivitamine C. Cette observation con- stitue une raison particuli~re d'int@r6t pour ce probl@me en rapport @troit avec l 'alimentation humaine.

En raison de leur oxydabilit6, l'acide ascorbique et l'acide isoaseorbique sont des antioxyg~nes puissants, ce qui justifie leur emploi dans la conservation de certaines denr@es alimentaires et boissons. BO~ENS~EI~ (1965) reeommunde l'utilisation de l'acide isoascorbiq~le pour lea produits alimentaires qui contiennent l 'acide ascorbique en q~anti~6 plus 61ev6e (jus d'orange, de grape fruit etc.). Le but de eette communication est de d6montrer dans quelle mesure l'acide D-isoascorbique influence lo d6termination de l'acide L- ascorbique.

Considdrant que dans les produits alimentaires on pourrait t rouver l'acide L-ascorbique et l'acide D-isoascorbique Fun ~ c6t6 de l 'autre, il eat n6cessaire d'@laborer les m6thodes qui permettent le dosage de chacun de ces deux acides. Les t ravaux de divers auteurs (MAPsOiN, CHEN, ])ATTERSON, STAI-IL et coll.) out ddmontr6 que par chromatographie sur papier et par ]a chromatographie en couehe mince on obtien¢ ]es valeurs diff@rentes de R f pour l'acide L~ascorbi-

ACIDE ASCORBIQVE ET ISOASCORI~IQUE 211

queet pour l'aeide D-isoaseorbique. Mais ees auteurs n 'ont eependant ]?as signald s'ils avaient r@ussi & s@arer ees aeides de leurs mdlanges. Duns ee but, nous avons fuit de nombreux essais pour ddterminer le taux de l'aeide L-aseorbique en pr6senee de l'aeide D-isoaseorbique.

Duns nos essais nous avons employ6 plusieurs mdthodes, mais duns eette communication nous ne parlerons que de ]a ehromato- graphie sur papier deseendante et de la ehromatographie sur eouehe mince.

Ces aeides out 6t@ ddtermin@s par la m6thode TILLMa~S et lu m6thode ROE-K~y~:T~m Nous averts essay6 par ]a m6thode RoE- KUET~E~ de les s@parer sous forme de 2,4-dinitroph@nylhydru- zones. On a eonstat4 que les ueides examinds et leurs m61unges r6agissen~ de la m@me manigre. D~s le d6but de notre travail nous nous sommes rendu eompte des diNeult6s qui nous at tendent pour s@arer ees deux stdr@o-isom~res.

Nous avons done examin6 le eomportement de ees aeides dans tes diffdrents systgmes solvants. Consid6rant que Ia ehromatographie sur pupier est essentiellement une ehromatographie de partage, mais que les phgnom~nes d'adsorption y prennent 6ga]ement part et que sa r6ussite d@end dn systgme des solvants et de ]a nature du papier, nous avons 6t~. obliges de faire de nombreux essais prgliminaires.

Systgme-sotvant : n-butanol-ae, oxal.-eau (20 : 1 : 30) phdnol-ae, ae5t. glae.-eau (99 : 1 : 100) n-butanol-ae, me&. glae.-eau (40 : 10 : 50) ph@nolo-ae, oxM.-eau (99 : I : 100).

En dehors des systgmes-solvants nous avons utilisg d'autres artifices. Au fond de la cure g ehromatographie on a mis quelques eristaux de KCN.

Papier: Whatman N ° 1 Whatman N ° 1 impr@gn6 d'aeide mgtaphosphorique g des

concentration de 1 }oet de 3 ~ . Sehleieher & Sehiill N ° 2043b Mgt MN 214 (Maeherey-Naget) Rinzer

Le dgveloppement des ehromatogrammes a @t6 fair au eours de 30 et 45 h. g la temp6rature de 20°C.

212 ~', PAZAI~INCEVIC ~ A. DA3/IANSKI

Les eh romatogrammes ont 6t~ rgvgl6s avec : le r6aet i f au n i t r a t e d ' a rgen t ammoniacM, le rgact i f au 2,6-dichlorophgnol-indoph6nol et le r6act i f au c i t ra te molybdgne ammoniaca l ( tampon)

Nous ~vons r6ussi ~ s6parer l 'acide ascorbique et l 'acide D- isoaseorbique de leur m61ange par le sys t6me-solvant : ph6nol-ac. ac6t. glac.-eau (99 : 1 : 100) sur papicr W h a t m a n N ° 1 impr6gn6 d 'acide m6ta-phosphor ique & 3 °/o.Nous n ' avons pas r6ussi ~ s6parer ces acides de leurs m61anges par les autres syst6mes-so]vants sus- indiqu6s, quoiqu e les valeurs Rf des substances pures diff6rent net te- men t en t re ellcs.

Notons que les valeurs R f des taches form@s par les m61anges de ees aeides sent les suivantes :

L 'ac ide ascorbique pur 0,28 L 'ac ide isoascorbique pur 0,31 M61ange de AAS-AIS 1 : 1 0,29

. . . . . . 2 : 1 0,29

. . . . . . I : 2 0,30

Nous citerons en exemple une de nos exp6riences qui eoneerne les aeides purs par le systgme-solvant : bu tano l satur~ par l 'eau, acide oxMique (20 : 1 : 30) sur le papier W h a t m a n N ° 1 imprggn~ d 'aeide m~ta-phosphor ique £ 3~o. P a r ce syst~me nous n ' avons psas r6ussi s@arer ees aeides de lem ~ mglange.

Acide ascorbique pur Acide isoascorbique pur

tel 0,26 pendt 5 h. 30; 0,28 pendt 14 h. 30 : 0,29 pendt 5 h. 30; 0,31 pendt 14 h. 30 Perte : apr~s 5 h. 30 0% : 2,1% apr~s 14 h. 30 7,0% : 14,0%

Les dosages ont toujours d4montr6 que la per te la plus 61ev6e concernai t l 'acide D-isoascorbique.

Nous avons 6galement essay6 de s6parer ces denx acides par la m6thode chromatograph ique en conche mince, mais not re t en t a t i ve n 'a pas r6ussi. Les r6ussi. Les exp6riences ont 6t6 faites de la mani~re suivante :

Nons avons appliqu6 la t echnique s t andard mise au point par STAHL sur l 'apparei l de la Maison Desaga, fournissant des couches d '6paisseur de 250#. La couche-suppor t a un aspect homoggne & la

ACIDE ASCORBIQVE ET ISOASCORBIQUE 213

lumi~re r~fl@hie. On a pr@ar~ s@ar~ment des couches de cellulose MN 300 et d'acide silicique (KIESELGEL G. , ,MERCK") La s@aration de ces deux acides a 6td faite sous la forme des acides purs et de leurs osazones. On a utilis5 plusieurs systSmes-solvants pour leur d~veloppement :

Chloroforme-acgtate d'6thyle (1 : 1) (1) Ethanol absolu (2) Eau bidistill6e (3) Ac.ac6t. glac.-ac6tone-eau (99 : 1 : 100) (¢)

On a essay6 aussi de ms s6parer par la chromatographie bi- dimensionnelle en employant les paires des solvants sus-indiqu6s:

( 1 ) - ( 2 ) ( 1 ) - ( 4 ) ( 2 ) - ( 4 ) ( 1 ) - ( 2 ) ( 2 ) - ( 3 ) ( 3 ) - ( 4 )

Les chromatogrammes des acides puts ont dt~ rdvdlds par le rdactif au tampon citrate de molybdgne ammoniacal, qui s'est rdvdld le meilleur rdv61ateur dans nos experiences.

Ces essais ddmontrent qu'il n'est pas possible de r~aliser la s@aration des compos~s examin@ de leur mdlange, bien qne les valeurs de Rf des solutions pures de l'acide L-ascorbique et de l'acide D-isoascorbique dans les solvants employds different entre enx.

CONCLUSION

Apr~s de nombreuses exp6riences nous avons r~ussi g s@arer clairement l'acide L-ascorbique de l'acide D-isoascorbique par la chromatographic sur papier Whatman N ° 1 impr6gn6 d'acide mdta- phosphorique de 3% en utilisant le syst~me-solvant ph@ol-ac.ac~t. glac.-eau (99 : 1 : 100), au eours de d~veloppement du chromatogram- me A 20 ° C pendant 45 heures. La valeur de Rf de l'acide L-aseorbique est 0,43 ct de l'acide D-isoascorbique : 0,47. Cette m~thode est semi- quantitative, si l'on tient compte que dans les conditions exp&imen- tales d@rites les pertes pour les deux acides se situent a : pour AAS 35%, pour AIS 41%.

R ~ s w ~

Par ]es propri~t6s physico-chimique ces deux acides isom~res sont tr~s semblables, tandis qne par leur action biochimique ils diff6rent. Ces compos& sont utilis6s pour la conservat, ion des produits alimentaires. L'acide D-iso-ascorbique se trouve tr~s

214 F. :PAZARINCEVI(~ & 2k. DAMANSKI

rarement dans le mat6riet naturel. Le but de cette communication est de constater en quelle mesure l'acide D-isoascorbique a de Fin- fluenee sur ta d6termination d'aeide L-aseorbique.

La s@aration de l'acide L-aseorbiqne et de l'acide D-isoaseorbique est faite par le m61ange ph6nol/Glae.ae.ac6t./eau (99 : 1 : 100) sur papier Whatman N O 1, impregn6 avec l'acide m6ta-phosphorique 3O/o . Rr: pour l'aeide L-ascorbique 0,43 et pour l'acide Ddsoaseor- biqne 0,47.

SvM~A~Y

By their physico-chemica, l-properties the t w o isomer acids are very similar to each other, while they differ by their biochemical action. These compounds are used in the preserva,tion of food products. D-isoascorbic acid is very seldom found in natural ma- terials. The aim of this communication is co show how much D- isoascorbic acid can influence the determination of L-ascorbie acid.

Z U S A M M E N F A S S U N G

Hinsichtlich ihrer physikMisch-ehemischen Eigenschaften sind die zwei isomeren S£uren sehr /~hnlieh, aber ihrer bioehemisehen Wirkung nach sind sie verschieden. Die Verbindnngen werden zur Konservierung yon Nahrungsmitteln benutzt. Die D-iso-Ascorbin- sgure befindet sich sehr selten in n&ttirlichen Prodnkten. Zweck die- ser Mitteilnng ist, zu beweisen, in welchem Mag die D-iso-Ascorbin- s~ure einen Einflug auf die Bestimmung der L-Ascorbins/iure hat.

Die Trennung der L-Ascorbins/~ure nnd der D-iso-Aseorbins/~ure wird erhMten durch da~s Gemiseh Phenol-Eisessigs/iure-Wasser (99 : 1 : 100) a~lf Whatman Papier No 1, irnpr/~gniert mit 3%iger Metaphosphors/iure. Rf = 0,43 fiir L-Aseorbins/~ure, Rf ---- 0,47 fiir D-iso-Ascorbins/~ure.

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