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Disponible en ligne sur

www.sciencedirect.com

Transfusion Clinique et Biologique 20 (2013) 35–39

Article original

Système RH : dépistage de D partiels avec RHD/RHCE gène hybride

System RH: Screening of partials D with RHD/RHCE hybrid gene

M. Ouchari a, S. Jemni Yacoub a,∗, B. Houissa a, S. Abdelkefi a, T. Chakroun a,M. Bouslama a, I. Jerray a, S. Belhedi a, S. Hmida b

a Unité de recherche « UR06SP05 », centre régional de transfusion sanguine, Sousse, Tunisieb Département d’immunohématologie, centre national de transfusion sanguine, Tunis, Tunisie

Disponible sur Internet le 21 mars 2013

ésumé

ut de l’étude. – La détermination du phénotype RhD est importante en médecine transfusionnelle. Toutefois, la complexité de l’expression de’antigène D est à l’origine des discordances observées entre deux déterminations sérologiques et à l’omission par sérologie de certains variantsui peuvent entraîner une allo-immunisation. Par conséquent, il est important de connaître dans une population les allèles RHD responsables dehénotypes D partiel et D faible. Le but de ce travail est le dépistage de D partiel avec RHD/RHCE gène hybride par PCR-multiplex.ujets et méthodes. – Notre étude a concerné 308 donneurs de sang du Sahel tunisien (269 D positif et 39 D négatif). Nous avons utilisé la techniquee PCR-multiplex pour amplifier les exons spécifiques du gène RHD 3, 4, 5, 6, 7, 9 et 10. D’autres investigations moléculaires ont été réaliséesour caractériser les variants RHD dépistés par la PCR-multiplex.ésultats. – Parmi les 269 échantillons D positif, un seul cas a montré l’absence d’amplification des exons 4 et 5 du gène RHD. Ce variant a été

dentifié en un D faible type 4 par PCR-SSP. Aucun des exons RHD n’a été amplifié à partir de l’ADN de 39 échantillons D négatif ce qui est enaveur d’une délétion totale du gène RHD.onclusion. – Nous n’avons trouvé aucun variant D partiel avec RHD/RHCE gène hybride. Les résultats des sujets D négatif ont montré que laélétion du gène RHD est le mécanisme le plus fréquent du phénotype D négatif dans la population tunisienne.

2013 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.

ots clés : PCR-multiplex ; PCR-SSP ; D partiel ; D faible ; Génotypage RHD ; Tunisie

bstract

im of the study. – The determination of the RhD phenotype is important in transfusion medicine. However, the complexity of the expression ofhe D antigen is the cause of the discrepancies observed between two serological determinations and the omission by serology of some variantshat can be cause alloimmunization. Therefore, it is important to known in a population the RHD alleles responsible for partial D and weak Dhenotype. The aim of the study was the screening of partial D with RHD/RHCE gene hybrid by PCR-multiplex.aterials and methods. – Our study involved 308 blood donors from Tunisian Sahel (269 D positive and 39 D negative). We used the multiplex

CR assay to amplify specific exons of the RHD gene 3, 4, 5, 6, 7, 9 and 10. Further molecular investigations were carried to characterize the RHDariants that were detected by the multiplex.esults. – In the 269 D positive samples, one case showed the absence of amplification of exons 4 and 5 of RHD gene. This variant was identified

y PCR-SSP on weak D type 4. None of the RHD exons were amplified from DNA of 39 D negative samples in favor of a total deletion of theHD gene.

gene

onclusion. – We have no found any partial D variant with RHD/RHCE s the most frequent mechanism of D negative phenotype in the Tunisian po

2013 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.

eywords: PCR-multiplex; PCR-SSP; Partial D; Weak D; RHD genotyping; Tunisia

∗ Auteur correspondant. Centre régional de transfusion sanguine, hôpital Farhat-HaAdresse e-mail : saloua.jemni@rns.tn (S. Jemni Yacoub).

246-7820/$ – see front matter © 2013 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.ttp://dx.doi.org/10.1016/j.tracli.2012.11.002

hybrid. Results in D negative samples showed that RHD gene deletion

pulation.

ched, Sousse, Tunisie.

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6 M. Ouchari et al. / Transfusion C

. Introduction

Les groupes sanguins érythrocytaires peuvent être définisomme l’ensemble des variations allotypiques, génétiquementransmises, détectées par des anticorps à la surface de la mem-rane érythrocytaire. Le système de groupe sanguin ABO até le premier découvert en 1900 par Karl Landsteiner, vinrentnsuite les systèmes MNS et P1. Enfin, après le développementu test à l’antiglobuline permettant la détection des anticorps

non agglutinants », les découvertes des autres antigènes vont’enchaîner pour aboutir aujourd’hui à près de 270 antigènesegroupés en 30 systèmes. Parmi lesquels on trouve le systèmehésus (RH). Ce dernier est un système très polymorphe (pluse 56 antigènes, variants D faibles et D partiels), d’un intérêtlinique considérable en transfusion et en obstétrique du faite l’importante immunogénécité de ses antigènes en particulier’antigène D (RH1).

En fait l’antigène D responsable du phénotype RH : 1, estonsidéré comme une mosaïque d’épitopes ou sous-unités quiont toutes présentes chez les sujets RHD positifs (RH : 1) etoutes absentes chez les sujets RHD négatifs (RH : -1). Certainsujets de phénotypes RH : 1 peuvent produire un allo-anticorpsnti-D dirigé contre un ou plusieurs épitopes manquants, défi-issant ainsi les phénotypes « D partiel ». L’analyse moléculairee ces variants a montré que la perte d’expression de certainspitopes D est associée soit à des réarrangements géniques, soit

des mutations ponctuelles affectant les parties extracellulairese la protéine RhD [1,2].

La grande diversité de l’Ag D (D faibles et D partiels)xpliquent les discordances notées entre deux déterminationsérologiques, entre la sérologie et le génotypage et l’omissione certains variants par sérologie [3]. La connaissance de’allélisme RHD dans une population est d’une importance capi-ale pour le choix de la stratégie de génotypage, le choix deéactifs et des techniques de phénotypage. L’objectif de notre tra-ail est le dépistage des variants RHD avec RHD/RHCE gènesybrides chez les donneurs de sang par la technique de PCR-ultiplex ciblant les exons 3, 4, 5, 6, 7, 9 et 10 afin de guider les

émobiologistes pour la résolution des difficultés sérologiquest le choix de la bonne stratégie adapté à notre population enermes de prévention de l’allo-immunisation transfusionnelle etœto-maternelle.

. Sujets et méthodes

.1. Sujets

Trois-cent-huit donneurs de sang non apparentés (269 RH : et 39 RH :–1) ont été inclus dans l’étude. Pour chaque donneur,0 mL de sang a été prélevé sur EDTA.

.2. Méthodes

.2.1. Méthodes sérologiquesLe phénotype RH a été réalisé en double détermination.

ous avons utilisé l’anti-D (Diagast) pour la première déter-ination et l’anti-D (Biomaghreb) pour la deuxième. Ces deux

dcdd

e et Biologique 20 (2013) 35–39

éactifs possèdent les mêmes caractéristiques (RH1, clones3 × 61+P3 × 21223B10 +P3 × 290 +P3 × 35). L’anti-D uti-

isé est composé d’un mélange d’anticorps monoclonaux choisisour détecter la majorité des catégories d’antigène D connues.e mélange d’anticorps monoclonaux appartenant à la classees IgG et des IgM permet de combiner à la fois le pouvoirgglutinant fort des molécules IgM et la réactivité des IgG avec’antiglobuline permettant d’effectuer le test de Coombs indirectn tube. L’IgG du réactif permet le dépistage du D partiel DVI

n technique d’hémagglutination directe. La recherche d’unexpression affaiblie de l’antigène D a été effectuée systématique-ent par test Coombs indirect en tube et en gel test. Le phénotypeH2, RH3, RH4 et RH5 a été réalisé en double déterminationar des anticorps monoclonaux IgM (Bio-rad®) : anti-C (RH2,lone MS24), anti-E (RH3, clone MS260), anti-c (RH4, cloneS33), anti-e (RH5, clones MS16, MS21, MS63).

.2.2. Méthodes moléculaires

.2.2.1. PCR-multiplex. L’ADN des différents échantillons até extrait grâce à la méthode saline « salting out » décrite pariller et al. [4]. L’ADN de 308 donneurs a été analysé par la

echnique de PCR-multiplex. C’est une technique, adoptée paraaskant et al. [5], permettant d’amplifier les différents exons

3, 4, 5, 6, 7et 9) du gène RHD. Cependant, nous avons inclus enlus les amorces spécifiques de l’exon 10 du gène RHD. Nousvons utilisé les amorces choisies par Maaskant et al. [5] et pour’exon 10 sont celles utilisés par Wagner et al. [6] (Tableau 1).e couple d’amorces (BACTs/BACTas) [5] (Tableau 1) est uti-

isé comme contrôle interne permettant l’amplification d’uneégion conservée du gène de la protéine �-actine. Ce couple’amorces témoin est intégré dans la réaction afin d’éviter lesésultats faussement négatifs.

Les réactions d’amplification ont été réalisées dans un volumeotal de 25 �l contenant 250 ng de l’ADN extrait, 1 × le tam-on PCR, 200 �M de chaque dNTP, 3,5 mM de MgCL2, 2 Ue l’ADN Taq polymérase (Dream TaqTM DNA polymerase,ermentas) et les amorces oligonucléotidiques à différentesoncentrations (Tableau 1).

L’amplification a été réalisée dans un thermocycleur (Genemp® PCR system 9700) selon le programme suivant :

une dénaturation initiale à 95 ◦C pendant cinq minutes ;32 cycles (une minute à 95 ◦C, une minute à 58 ◦C et45 secondes à 72 ◦C) ;

une extension finale à 72 ◦C pendant une minute.

La visualisation des amplicons a été réalisée par électro-horèse sur gel d’agarose en présence de Bromure d’ethidiumBET).

.2.2.2. PCR-SSP appliquées à la recherche de deux mutations602G et T667G (variant D faible type 4). L’éclaircissementu mécanisme moléculaire du variant dépisté par la technique

e PCR-multiplex a nécessité la réalisation de deux PCR-SSPiblant les deux mutations C602G et T667G localisées au niveaues exons 4 et 5 du gène RHD respectivement. Nous avons utiliséeux couples d’amorces (gwd4b/gwd4a) [7] et (Rh223vf/ga51)

M. Ouchari et al. / Transfusion Clinique et Biologique 20 (2013) 35–39 37

Tableau 1Les amorces utilisées pour l’amplification des différents exons du gène RHD [5,6].

Amorces Direction Séquences Position Exon RHD Taille (Pb) Concentrations(nmole/L)

R364 Sens 5’TCGGTGCTGATCTCAGTGGA3’ 364–383 3 111 81,1R474M Antisens 5’ACTGATGACCATCCTCATGT3’ 455–474 82,6R496 Sens 5’CACATGAACATGATGCACA3’ 496–514 4 126 54,7R621 Antisens 5’CAAACTGGGTATCGTTGCTG3’ 602–621 48,7R648 Sens 5’GTGGATGTTCTGGCCAAGTT3’ 648–667 5 157 323Rex5AD2 Antisens 5’cacCTTGCTGATCTTACC3’ 787–801 371,2R898M Sens 5’GTGGCTGGGCTGATCTACG3’ 898–916 6 57 85,08Rex6AD3 Antisens 5’tgtctagtttcttacCGGCAAGT3’ 932–939 71,1R973 Sens 5’AGCTCCATCATGGGCTACAA3’ 973–992 7 96 82,1R1068 Antisens 5’ATTGCCGGCTCCGACGGTATC3’ 1048–1068 78Rex9SD2 Sens 5’aacagGTTTGCTCCTAAATATT3’ 1154–1170 9 71 175R1219M Antisens 5’AAACTTGGTCATCAAAATATTTAACCT3’ 1193–1219 175re91 Sens 5’CAAGAGATCAAGCCAAAACCT3’ –40 intron 9 385 100rr4 Antisens 3’AGCTTACTGGATGACCACCA5’ 1,541–1,522 3’UTRa 100BACTs Sens 5’CCTTCCTGGGCATGGAGTCCTG3’ 200 100BACTas Antisens 5’GGAGCAATGATCTTGATCTTC3’ 100

a 3’ UTR : 3’ untranslated region of exon 10.

Tableau 2Les couples d’amorces utilisés pour la PCR-SSP (variant D faible type 4) [7–9].

Couples d’amorces Séquences Spécificité Amplicons (Pb) Concentrations(nmole/L)

gwd4a 5’AGACTACCACATGAACATGATGCACA3’ Mutation C602G au niveau de l’exon 4 du gène RHD 138 200gwd4b 3’CAGACAAACTGGGTATCGTTGCTC5’ 200Rh223vf 5’TTGTGGATGTTCTGGCCAAGTG3’ Mutation T667G au niveau de l’exon 5 du gène RHD 164 200ga51 3’CTGCTCACCTTGCTGATCTTCCC5’ 200H e l’hH

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dRu5etmutations G602 et G667 par la technique de PCR-SSP était enfaveur d’un variant D faible type 4 (Fig. 2). Ainsi, nous n’avonsdépisté aucun variant D partiel lié à un réarrangement génique.

Tableau 3Fréquences des différents phénotypes.

Antigènes Phénotypes Fréquences (%)

D C c E e+ + + – + DCcee (R1r) 37,66+ + – – + DCCee (R1R1) 14,96+ – + – + Dccee (R0r) 14,93+ + + + + DCcEe (R1R2) 12,02+ – + + + DccEe (R2r) 6,81

GHF 5’GCCTTCCCAACCATTCCCTTA3’ Gène dGHR 3’TCACGGATTTCTGTTGTGTTTC5’

8] spécifiques de deux mutations 602G et 667G respectivementTableau 2). Un couple d’amorces témoin (HGHF/HGHR) [9]Tableau 2) amplifie une région conservée du gène de l’hormonee croissance est intégré dans chaque réaction.

Les réactions d’amplification ont été réalisées dans un volumenal de 10 �l dont le mix est composé de 250 ng de l’ADNxtrait, 1 × le tampon PCR, 200 �M de chaque dNTP, 1,5 mMe MgCL2, 0,3 U de l’ADN Taq polymérase (Invitrogen) etes amorces oligonucléotidiques à différentes concentrationsTableau 2).

L’amplification a été réalisée dans un thermocycleur (Genemp® PCR system 9700) selon un programme d’amplificationarticulier appelé « Touch-down » : une dénaturation initiale à4 ◦C pendant deux minutes, dix cycles (dix secondes à 94 ◦C,

minute (hybridation/élongation) à 65 ◦C), suivie par 22 cycles30 secondes à 94 ◦C, une minute à 63 ◦C et 30 secondes à 72 ◦C)t une extension finale à 72 ◦C pendant dix secondes. Les ampli-ons ont été révélés sur gel d’agarose en présence de BET parlectrophorèse horizontale.

. Résultats

L’étude a porté sur 269 donneurs de sang de phénotype RH : (87,34 %) et 39 donneurs de sang de phénotype RH : –112,66 %). Les phénotypes des donneurs sont résumés dans le

+

––

ormone de croissance : contrôle interne 429 100100

ableau 3. Dans notre population d’étude, le phénotype le plusréquent est DCcee (R1r) exprimé chez 37,66 % des donneurs.

Le résultat d’amplification du gène RHD par la techniquee PCR-multiplex a montré l’absence de tous les exons du gèneHD chez les sujets RH : –1. En revanche, chez les sujets RH :1,n seul échantillon (0,32 %) a montré l’absence des exons 4 et

du gène RHD (Fig. 1). L’échantillon dépisté avec absence desxons 4 et 5 du gène RHD peut être associé, soit au variant DVI

ype I, soit au variant D faible type 4. La recherche de deux

– + + – DccEE (R2R2) 0,97

– + – + ddccee (rr) 11,03+ + – + ddCcee (r’r) 1,62

38 M. Ouchari et al. / Transfusion Cliniqu

Fig. 1. Profil éléctrophorétique de la PCR-multiplex ciblant les exons 3, 4, 5, 6,7, 9 et 10 du gène RHD. M : marqueur de taille de 25 pb ; CI : contrôle interne (�ad

4

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ctine) ; 1 : sujet de phénotype RH : 1 ; 2 : variant (exons 4 et 5 absents) ; 3 : sujete phénotype RH :–1.

. Discussion

Au cours de cette étude, afin de dépister les D partiels avecHD/RHCE gène hybride dans notre population, nous avonstilisé la technique de PCR-multiplex. Cette technique permete dépistage des allèles RHD liés à un réarrangement géniqueDIIIc, DVa, DIVb, DIV type 3, DIV type 4, DIV type 5, DV type, DV type 2, DV type 3, DV type 6, DV type 7, DV type 8,VI type I, DVI type II, DVI type III, DVI type IV, DFR, DFR

ype 2, DFR type 3, DFR type 5, DBS-1, DBS-2, DCS-1, DBType I, DBT type II et DHAR). Cependant, certaines catégo-ies D partiels liées à plusieurs substitutions d’acides aminesDIIIa, DIII type 4, DIII type 5, DIII type 6, DIII type 7, DIII

ype 8, DIVa, DIVa-2, DAU-5, DFV et DTO) et certaines caté-ories D faibles (D faibles types 4.0, 4.0.1, 4.1, 4.2.0, 4.2.1,.2.3, 4.3, 14, 29, 40, et 51) peuvent être dépistées. Elle permetussi d’orienter chez les sujets RH : –1 vers certains variantsrédominants dans les populations africaines tels que le pseu-ogène RHD � et d(C)ces. Ces deux variants donnent des profilslectrophorétiques caractérisés par l’absence de l’exon 5 en cas

e présence de RHD � et par la présence seulement de l’exon

du gène RHD en cas de présence de d(C)ces. Il est impor-ant de signaler que le résultat est strictement normal en cas de

Eda

ig. 2. Profils éléctrophorétiques de deux PCR-SSP (variant D faible type 4). A. Prohorétique de la PCR-SSP (exon 5 du gène RHD). M : marqueur de taille de 25 pb ; 1

faible type 4/D faible type 4 ou D faible type 4/délétion.

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ertains D partiels liés à des mutations (DII, DVII, DNU, DHMit DHR). Par rapport à la technique de Maaskant et al., nousvons inclus l’exon 10 afin de mieux caractériser le DHAR. Ceernier est particulier par le fait qu’il ne comporte ni le gèneHD, ni le gène RHCE mais un seul gène hybride RHCE-D-CEe possédant que l’exon 5 du gène RHD [10]. En effet, selon lehésus base (http://www.uni-ulm.de/∼fwagner/RH/RB/) tous

es allèles RH : 1 (D faible et D partiel) et RH : –1 (RHD � et(C)ces) décrits jusqu’à maintenant ont l’exon 10 à l’exceptione l’allèle DHAR. Nous n’avons pas amplifié les exons 1, 2 et

vue la similarité des séquences nucléotidiques entre le gèneHD et le gène RHCE au niveau de ces trois exons.

Dans notre population d’étude, le phénotype le plus fréquentst DCcee (R1r) exprimé chez 37,66 %. Cette fréquence estomparable à celle déjà rapportée par Hmida et al. (DCcee :8 %) [11].

Malgré que notre objectif est le dépistage des variants RH : liés à un réarrangement génique entre le gène RHD et le gèneHCE, nous avons inclu les sujets de phénotype RH : –1. Cette

nclusion est justifiée par le fait que certains variants RH : 1 liés un allèle hybride ont un nombre de site antigénique réduitar cellule. Ces variants peuvent être typés faussement néga-ifs par sérologie (DVI type I : 300 antigènes/cellule) [12,13].ette omission de certains variants par les techniques sérolo-iques a été rapportée par plusieurs auteurs. En effet, en Sude Californie [14] chaque année 120 donneurs du sang de phé-otype D faible sont omis par les techniques sérologiques etransfusés à des sujets RH : –1. En Autriche, le génotypage de38 échantillons RH : –1 avec Ag C et/ou E positif a révélé 3 Daibles, 5 D partiels et 7 Del [14]. En Allemagne, une étudeéalisée sur 46 133 donneurs de phénotype RH : –1 durant sixnnées a révélé 96 variants dont la majorité sont de phénotypeel et D faible type 11 [15]. L’analyse par multiplexage a montré

’absence de tous les exons du gène RHD chez les 39 sujets RH :1. Ce résultat confirme la prédominance de la délétion totalen tant que mécanisme moléculaire chez les RH : –1. Concer-ant les sujets RH : 1, un seul échantillon a montré l’absence desxons 4 et 5 suggérant la présence d’un allèle associé soit au phé-otype D partiel DVI type I, soit au phénotype D faible type 4.

n effet, les deux mutations (C602G et T667G) caractéristiquesu variant D faible type 4 sont localisées à l’extrémité 3’ desmorces utilisés (R621/R648) pour l’amplification des exons 4 et

fil éléctrophorétique de la PCR-SSP (exon 4 du gène RHD). B. Profil éléctro- : témoin positif (D faible type 4.0) ; 2 : sujet de phénotype RH : 1 ; 3 : variant :

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M. Ouchari et al. / Transfusion C

du gène RHD. L’analyse par PCR-SSP a montré l’associatione ce variant au phénotype D faible type 4 (D faible type 4/Daible type 4 ou D faible type 4/délétion) (0,32 %). Le variant Daible type 4 est divisé en quatre sous-classes (D faible type 4,0,ype 4.1, type 4.2 et type 4.3). Les différents allèles appartenant

la catégorie D faible type 4 présentent tous les substitutionshr201Arg (C602G) et Phe223Val (T667G) qui sont associées

une ou plusieurs substitutions supplémentaires en fonction de’allèle concerné [16]. Donc, afin de connaître exactement le type’allèle, cette technique doit être associée à une autre techniquee biologie moléculaire telle que le séquencage ou PCR-SSPiblant les mutations caractéristiques de chaque sous-type. Leisque d’allo-immunisation des variants D faibles est souventgnoré, cependant des allo-anti-D ont été décrits chez certainsariants D faibles en particulier le type 4.2 [17].

L’absence de D partiels avec RHD/RHCE gène hybride dansotre série nous ne permet pas d’apporter des conclusionsoncernant les fréquences de ces variants dans notre populationue la taille réduite de l’échantillon et la fréquence relative-ent faible de ces variants dans certaines populations. En effet,

es fréquences de D partiels varient d’une ethnie à une autre.ans la population de race blanche, les fréquences des variantsVII, DVI, DIV, DV, DII et DFR sont 1:900, 1:6800, 1:10,000,:30,000, 1:30,000 et 1:60,000 respectivement [18]. Chez lesndividus de race noire, la fréquence de certains variants D par-iels (DIIIa, DIIIb et DIVa) est relativement plus élevée [19,20].

Il est important d’apprécier la fréquence de D partiels liés à unéarrangement génique en particulier le variant D partiel DVI vueon implication clinique. En Europe, le DVI est le plus fréquem-ent associé à une allo-immunisation d’où les recommandations

e sélectionner un anti-D monoclonal ne reconnaissant pas cetteatégorie pour les receveurs potentiels de produits sanguinsabiles et les femmes enceintes pour une meilleure préventione l’allo-immunisation transfusionnelle et fœto-maternelles [1].n Tunisie, ces dernières recommandations ne sont pas respec-

ées. En effet, l’anti-D que nous utilisons pour les receveurs desroduits sanguins et les donneurs permet de reconnaître le DVI

n technique d’hémagglutination directe.La fréquence des variants RHD avec RHD/RHCE gène

ybride apparaît rare dans notre population, cependant il fautlargir le nombre d’échantillons pour déterminer les allèlesHD les plus fréquentes ce qui permettra de mieux guider

’hémobiologiste pour le choix des réactifs afin d’assurer uneeilleure prévention d’allo-immunisation anti-D et d’aider à la

ésolution des difficultés sérologiques.

éclaration d’intérêts

Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d’intérêts enelation avec cet article.

[

e et Biologique 20 (2013) 35–39 39

éférences

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