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TD préparatoire aux TP de biochimie 2ème série
1ère année IUT GB
Stéphane Goulaouic, d’après Laurent Foucaud
Présentation des TPSérie de TP centrée sur les protéines
CaractérisationDétermination de leur activité enzymatique
5 séances de TP
TP tournants (sauf TP 3 : 1ère semaine)
Consignes pour les TPElles sont identiques à celles de la première série !
Il faut avoir étudié le protocole avant de venir
Indiquer les points essentiels sur son cahier de paillasse,
A chaque séance le matériel nécessaire est : cahier de paillasse, calculatrice, papier millimétré
Une évaluation en cour de séance est réalisée par l’enseignant, des erreurs graves de manip, un mauvais comportant, un poste de travail et une salle sale entraîneront un retrait de points
Consignes pour les TP
Les comptes rendus de la séance sont à rédiger pour la séance suivante (aucun retard ne sera accepté, sous peine de perte de points) soit une semaine
Dans le compte rendu il n’est pas nécessaire de rappeler le protocole, on précise le but de la manipulation et on apporte un soin particulier à la présentation des résultats et à leur interprétation
TP 1 et 2 : Séparation et caractérisation
TP 1 : Techniques de chromatographie
TP 2 : Séparation de protéines par électrophorèse
TP 1 : Les techniques de chromatographie La chromatographieLa chromatographie est une méthode d'analyse qui sépare
les constituants d'un mélange par entraînement à l'aide d'une phase mobile liquide ou gazeuse (éluant) le long d'une phase stationnaire solide ou liquide qui porte les solutés à traiter
La vitesse de migration d’une substance est la résultante de 2 forces :migration due à la solubilité dans l'éluant rétention due à l'affinité dans la phase fixe
A BMigration
Rétention
La résultante de ces deux forces étant variable selon le produit concerné, celui-ci migrera donc à une vitesse caractéristique
Chromatographie sur couche mince (CCM)
Repose sur des phénomènes d’adsorption :
la phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants,
elle progresse le long d’une phase stationnaire fixée sur une plaque de verre ou sur une feuille semi-rigide de matière plastique ou d’aluminium.
TP 1 : Les techniques de chromatographie
CCM
Cuve
Couvercle
Phase mobile
(solvant de migration)
Phase stationnaire
(plaque de silice)A B C X
Front d’élution
TP 1 : Les techniques de chromatographie
La phase mobile utilisée est la suivante : Buthanol 16 mL Acide acétique 8 mL Eau 4 mL
Caractériser ce mélange
Le mélange est constitué de solvants organiques très polaires (un alcool et un acide), ils vont donc facilement entraîner les molécules hydrophiles notamment les molécules polaires.
Structure générale des acides aminés
- Molécule hydrophile plutôt polaire- Caractère plus ou moins polaire en fonction du radical
TP 1 : Les techniques de chromatographie
4 standards :
L’acide aminé le plus simple, il est très polaire et petit
est très polaire avec une fonction acide supplémentaire, cette fonction est même ionisable.
AA basique ionisable, il est polaire également mais plus gros
La proline est un AA non polaire et petit, c’est un cas particulier (la coloration avec la ninhydrine est différente des autres)
Glycine
Proline
Histidine
TP 1 : Les techniques de chromatographie
Acide glutamique
La gel filtration sur colonne
Le gel est un séphacryl (polyholoside à très haut poids moléculaire) qui gonfle en solution
Il forme ainsi des mailles plus ou moins grosses de tailles variables dans lesquelles les protéines vont pouvoir circuler
On sépare des molécules dans une certaine gamme de poids moléculaire
Si les molécules absorbent à une longueur d’onde commune, on peut toute les mesurer au spectrophotomètre cela permet d’identifier les fractions qui contiennent les molécules séparées dans chaque fraction
TP 1 : Les techniques de chromatographie
Composés à séparer bleu Dextran (très grosse molécule 2000 kDa,
polysaccharide)hémoglobine (PM 68 kDa)catalase (PM 220 kDa)
Quel sera le comportement du bleu Dextran dans la colonne ? il ne va pas pénétrer dans le gel et donc il sortira très vite il permet donc d’évaluer le volume mort ou le volume
d’exclusion de la colonne (le liquide qui ne se trouve pas dans le gel)
TP 1 : Les techniques de chromatographie
Principe
L’électrophorèse permet de séparer les protéines d’un mélange (en principe selon les charges sous l’effet d’un courant électrique)
Dans le cas présent les protéines seront séparées en fonction de leur masse moléculaire
En comparant la migration d’un échantillon de protéines inconnues avec celle d’un standard on peut déterminer la masse moléculaire relative des protéines contenues dans l’échantillon
Que signifie SDS - PAGE ?
Sodium dodécyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis
Il s’agit donc d’une électrophorèse dans un gel de polyacrylamide (qui constitue un tamis moléculaire) en conditions dénaturantes
TP 2 : Séparation de protéines par électrophorèse
Effet du SDS et du β-mercaptoéthanol sur les protéines ?
Le SDSLe SDS est un détergent, il dénature les protéines et les charge négativement pour permettre une migration selon la taille et non pas la charge
Le Le ββ-mercaptoéthanol-mercaptoéthanol rompt les ponts disulfures. Le chauffage dénature aussi les protéines
Les protéines sont dénaturées : elles ont perdu leur structure tridimensionnelle native
Les protéines n'ont plus de pont disulfure : elles sont sous une forme monomérique
TP 2 : Séparation de protéines par électrophorèse
Le gel de polyacrylamide est obtenu par polymérisation
Plus le pourcentage d'acrylamide est élevé, plus la densité des chaînes est élevée et les mailles du réseau sont serrées
Pourcentage d'acrylamide
Gamme de séparation en
kDa
7,5 45 - 400
10 22 - 300
12 13 - 200
15 2,5 - 100
En conséquence :
le % d'acrylamide est élevé, les molécules volumineuses peuvent migrer
une protéine globulaire (assimilable à une sphère) migre d'autant que sa masse molaire est élevée
+ __
moins
TP 2 : Séparation de protéines par électrophorèse
Détermination de la masse molaire d'une protéine
mobilité relative =
distance de migration d'une bande
-------------------------------------------------
distance de migration du front
TP 2 : Séparation de protéines par électrophorèse
• But : étudier la cinétique de dégradation de l’eau oxygénée par la catalase mais aussi d’évaluer l’influence de la concentration en enzymes sur cette cinétique
Les enzymes : des catalyseurs biologiques de réactions biochimiques
Vitesse initiale de réaction (apparition du produit) :
= k [S]
TP 3 : Dégradation de l’eau oxygénée par la catalase
TP 3 : Dégradation de l’eau oxygénée par la catalase
Dans la grande majorité des cas, la formation du produit est un phénomène exponentiel d'où la forme des cinétiques enzymatiques
L'amortissement en fin de cinétique résulte de la disparition du substrat voire de l'accumulation du produit et, en conséquence, de la diminution de la vitesse de la réaction enzymatique
Comment déterminer le temps de mesure d’une réaction enzymatique, comment évolue la quantité de substrats au cours du temps ?
Le corollaire comment évolue la quantité de produit ?
α
TP 3 : Dégradation de l’eau oxygénée par la catalase
La pente de la tangente à l'origine de la cinétique (d[P] / dt) s'appelle la vitesse initiale de la réaction enzymatique, vi
Comment déterminer le temps de mesure d’une réaction enzymatique, Comment évolue la quantité de substrats au cours du temps ?
Le corollaire comment évolue la quantité de produit
Dosage de l’enzymesubstrat en excès
(mesure cinétique)
Dosage du substrat substrat limitant
(mesure en point final)
TP 3 : Dégradation de l’eau oxygénée par la catalase
Le substrat doit –il être limitant ou en excès pour déterminer l’activité d’une enzyme ?
Qu’en est-il en terme d’application analytique ?
Au préalable on vous demande :
• D’écrire la réaction de dégradation de l’eau oxygénée au cours du dosage
• Déduire la relation entre le volume de permanganate versé et la concentration en eau oxygénée restante
Vous devez donner les tableaux de résultats
Un graphe de la concentration en eau oxygénée restante en fonction du temps : il s’agit de traduire la consommation du substrat par l’enzyme
Dans un deuxième temps pour différentes concentrations d’enzymes vous allez tracer sur un graphe la variation de substrat en fonction du temps : il s’agit de traduire les vitesses pour chaque quantité d’enzyme
Enfin pour chaque quantité d’enzyme, on calcule la vitesse et on traduit sur un graphe v= f(quantité d’enzyme)
TP 3 : Dégradation de l’eau oxygénée par la catalase
Si le produit d'une réaction enzymatique possède une propriété physico-chimique qui permet de le quantifier au fur et à mesure qu'il est formé, on peut suivre sa cinétique de formation
TP 4 : Paramètres cinétiques de la phosphatase alcaline
Les conditions optimales pour l’étude de la phosphatase alcaline devront être déterminées :
vitesse initiale Vm et Km effet du pH
Vm est la vitesse maximale de l'enzyme dans les conditions de l'expérience quand elle est saturée en substrat
Km est la concentration de substrat qui permet d'obtenir la moitié de la vitesse maximale. C'est aussi une bonne approximation de l'affinité de l'enzyme pour son substrat
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TP 4 : Paramètres cinétiques de la phosphatase alcaline
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TP 4 : Paramètres cinétiques de la phosphatase alcaline
TP 4 : Paramètres cinétiques de la phosphatase alcaline
TP 4 : Paramètres cinétiques de la phosphatase alcaline
pH Aux valeurs extrêmes, il dénature, donc désactive la protéine en modifiant l’état
d’ionisation des chaînes latérales des acides aminés Aux valeurs intermédiaires, il influe sur l’activité en modifiant l’état d’ionisation des
acides aminés du site actif et celui du substrat
-> courbe en cloche, en général Vi max pour des pH voisin de la neutralité
Température Accélère les réactions en fournissant l’énergie nécessaire au franchissement de
la barrière due à l’énergie d’activation Dénature progressivement (et désactive) les protéines (struct 2aire et 3aire)-> courbe dissymétrique, la vitesse est multipliée par deux tous les 10 °C jusqu’à
une température optimale, puis diminue rapidement
Les inhibiteurs Ils ralentissent la vitesse de réaction jusqu’à la stopper
Les facteurs influençant la réaction enzymatique
Le but du TP est de déterminer l’activité spécifique de la -fructosidase, une enzyme qui catalyse la transformation du saccharose dextrogyre en un mélange équimoléculaire de glucose et fructose qui est lévogyre, ce qui lui a valu le nom de sucre inverti
Mais aussi de tester l’effet d’un inhibiteur sur cette réaction enzymatique
L’unité enzymatique est la quantité d’enzyme qui catalyse la transformation de 1 micromole de substrat en une minute à 25°C dans les conditions optimales de pH et de concentration en substrat. Si on rapporte l’unité enzymatique à la masse de protéines (en générale au milligramme), on a l’activité spécifique
TP 5 : Activité spécifique de la -fructosidase
Les facteurs influençant la réaction enzymatique
Les inhibiteurs : ils ralentissent la vitesse de réaction jusqu’à la stopper.Réversibles
Compétitifs = analogues structuraux du substrat
1. Les inhibiteurs compétitifs Ils se lient de manière réversible au site actif de l'enzyme et en bloquent
l'accès au substrat. Ils diminuent donc la concentration d'enzyme libre ([E]). En général ils ressemblent chimiquement au substrat. D'ailleurs, si une enzyme a plusieurs substrats possibles, ceux-ci peuvent aussi agir comme inhibiteurs compétitifs réciproques.
Les facteurs influençant la réaction enzymatique
Les inhibiteurs : ils ralentissent la vitesse de réaction jusqu’à la stopper.Réversibles
Compétitifs = analogues structuraux du substrat
Non compétitifs = non analogues, se fixent sur un autre site
2. Les inhibiteurs non-compétitifs Ils se lient de manière réversible ailleurs qu'au site actif de l'enzyme et
n'en empêchent pas l'accès. Il s'agit donc d'inhibiteurs allostériques, c'est-à-dire agissant à un autre (allo-) site.
Le Km reste constant, mais il y a perte apparente de concentration d'enzyme, donc réduction de vmax.
Les facteurs influençant la réaction enzymatique
Les inhibiteurs : ils ralentissent la vitesse de réaction jusqu’à la stopper.Réversibles
Compétitifs = analogues structuraux du substrat
Non compétitifs = non analogues, se fixent sur un autre site
Inhibiteurs mixtes
3. Inhibiteurs incompétitifs
Les facteurs influençant la réaction enzymatiqueLes inhibiteurs : ils ralentissent la vitesse de réaction jusqu’à la
stopper.Réversibles
Compétitifs = analogues structuraux du substrat
Non compétitifs = non analogues, se fixent sur un autre site
Inhibiteurs mixtes
Irréversibles = liaison covalente au groupe fonctionnel indispensable à l’activité catalytique
