Examen Bactriologique des Aliments Auto-Contrle par les Professionnels

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K = txt.Lir

TD ENVT HIDAOA - Hubert Brugre, Denis CorpetMJ partielle janv 2013

Cadre rglementaireAbrogation de larrt du 21 dcembre 1979

relatif aux critres microbiologiques auxquels doivent satisfaire certaines denres dorigine animale.

Rglement CE 2073/2005 de la Commission Europenne Critres microbiologiques applicables aux denres alimentaires.

Un des rglement du Paquet Hygine, Applicable depuis le 1er janvier 2006.

On est pass d'un cadre strict, contraignant mais scurisant, avec des critres microbiologique imposs

A une "responsabilisation" moins confortable ! Consquence frquente = augmentation du nombre d'analyses microbiologiques !

FSO/ALOP based food safety policyFSO = Food Safety ObjectiveALOP = Appropriate Level of Protection

Objectif de Scurit de l'Aliment (FSO) = Frquence (ou concentration) d'un danger, dans l'aliment consomm, qui donnele niveau appropri de protection (ALOP).Exemple hypothtique de FSO: le niveau de Listeria monocytogenes dans un aliment prt l'emploi ne doit pas dpasser 3 Log CFU/portion (=1000 bactries)

Comment tablit-on les FSO partir des ALOP ?

Un peu de recherche prospective: Comment dcider "combien de bactries sont acceptables, combien sont "trop" ?"

-7

-6

-5

-4

-3

-2

2 3 4 5 6 7Log (Nb CFU pathognes) / Repas

L

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Epidmies relles observesDe ALOP FSO

La thorie

2- Choisir ALOP: par ex.on dcide qu'on veut Un "cas" malade pourUn million de repasDonc ALOP = 10-6

1- On construit la courbeobserve entre les caspidmiques et la contamination des repas(bcp d'incertitudes !!)

3- On en dduit qu'on Veut moins de 3.5 logDu pathogne par repasFSO = 3.5 log CFU4- Marge de scurit: Onmet le critre de scuritplus bas que le FSO,par ex < 100 CFU du pathogne FSO, Food safety objective

ALOP, Appropriate level of protection

ALOP

FSO

Loi dose-rponse exprimentale: plusieurs courbes en pratique !

Dose (exposition un nombre de bactries)

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The application of the Appropriate Level of Protection (ALOP) and Food Safety Objective (FSO) concepts in food safety management, using Listeria monocytogenesin deli meats as a case study Gkogka et al. Food Control February 2013 - Predictive Modelling of Food

Quality and Safety. 29 (2), 382393. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S095671351200182X#

1 Pour contribuer la protection de la sant publique et viter les interprtations diffrentes, il convient de dfinir des critres de scurit harmoniss relatifs lacceptabilit des denres alimentaires. critres de scurit des denres alimentaires

2 Les critres microbiologiques fournissent galement une orientation sur l'acceptabilit des denres alimentaires et de leurs procds de fabrication, de manutention et dedistribution. Lutilisation de ces critres devrait faire partie intgrante de la mise en oeuvre des procdures fondes sur les principes HACCP et les autres mesures de contrle de l'hygine. critres dhygine des procds

1 critres de scurit des denres alimentaires

2 critres dhygine des procds

Scurit = Pas de microbe pathogneont t retenus:

- Listeria monocytogenes- Salmonelles- Entrotoxine de Staph. aureus- Histamine (poissons)- Enterobacter sakasakii (actualit, lait poudre)- On ne cherche ni E.coli, ni virus (Norovirus, hpatite A), car on n'a pas de mthode fiable

Hygine procds = il ne faut pas "trop" de bactries banalespas "trop" de contaminants "tmoins" (d'origine fcale)

E. sakasakii : Quatre prmaturs infects en 2004 par le mme lait en poudre

Critre scurit // Critre hygine

Anarobies sulfito-rducteurs

Dnombrement: ralisation

Prlvement strile, transport au froid Prparation des 5 chantillons:

Aliment solide, broy dans un liquide strileRalisation de dilutions dcimales (1 dans 9)

K2

Dnombrement en milieu liquide Pour chaque srie de culture issue de la mme dilution

on compte le nombre de tubes positifs (3 sries identiques)

On compose le nombre caractristique, et la lecture de la table de Mac Grady nous donne le Nombre le Plus Probable: NPP.

Avantages: Mise en vidence dun caractre particulier Phase de ranimation, enrichissement tout fait pour suite

Inconvnients: Manque de prcision (variabilit de 1 log) Lourde mettre en oeuvre

K3

Source: ENSTA TD microbio

Table de Mac Gradypour 3 tubes par dilution

Dnombrement sur milieu solide Une bactrie, place sur un milieu favorable, donnera

naissance une colonie macroscopiquement visible. UFC = Unit formant colonie

Etalement en surface ou en profondeur

Avantages: Plus facile mettre en uvre Plus prcise (variabilit de 0.5 log) Mthode disolement

Inconvnients: Mthodes de revivification parfois ncessaire

K

Source: ENSTA TD microbio

Petrifilm

Ptrifilms ou boites de Ptri: quelles dilutions compter ? Comment calculer les UFC = nombre de bactries par g ou par ml ?Comment exprimer le rsultat ?

K

Flore Arobie Msophile Totale

Coliformes Totaux

Entrobactries

Coliformes Fcaux

E. coli Salmonella spp.

Staphylocoques coagulase +

Anarobies sulfito-

rducteurs

Micro-organismes dnombrs ou recherchsdans les analyses de routine => on va les voir plus en dtail

K

Milieux de cultureQuy a-t-il dans un milieu de culture ? N.S.

Flore arobie msophile totale = FAMT = Microorganismes Totaux Ensemble des germes capables de se dvelopper sur un

milieu nutritif 30C en arobiose.

Milieu ordinaire : glose pour dnombrement ou PCA, contenant peptone, glucose, extrait de levure.

Indicateur dhygine gnrale, valuation de laltration microbienne des denres

Attention flore technologique

Recherche de flores plus slectives pour certains produits

Milieux de culture slectifs

BLBVB ou le bouillon de Mac ConkeyE. coli

Glose dsoxychlolate lactoseBouillon lactos bili au vert brillant

Coliformes

Glose au cristal violet, rouge neutre, bile, glucose (VRBG) ou lactose (VRBL)

Entrobactries

Milieux de culture slectifs: inhibent la croissance de certains micro-organismes rvlent la croissance de ceux qui sont recherchs

VRBLHetkoen

Entrobactries Bacilles droits, Gram-, aro-anarobie

Rduction des nitrates en nitritesFermentation du glucoseOxydase ngatif

Nombreuses espces = htes normaux du tube digestif des animauxBactries fcales frquemment des contaminants alimentaires dorigine fcaleCertaines espces sont pathognes: lesquelles ?

Coliformes Coliformes (df. ISO) (qui a la forme de E.coli) :

Bacilles Gram-, non sporuls, aro-anarobies, capables de se multiplier en prsence de sels biliaires et en fermentant le lactose avec production dacide et de gaz 37C.

Coliformes thermotolrants ou fcaux: df. Idem 44C

E.coli prsums : Coliformes thrmotolrants + production dindole partir du typtophane.

E.coli : E.coli prsums + RM (rouge de mthyle) positifs, VP (Voges-Proskauer) ngatif, Citrate ngatif

Indicateurs de contamination dorigine fcale

Un indicateur doit: toujours tre prsent lorsque

les micro-organismes pathognes sont prsents

apparatre en plus grand nombre que les agents pathognes associs

avoir le mme comportement que les agents pathognes dans lenvironnement naturel et au cours des procds de fabrication

doit tre mis en vidence, dnombr et identifi laide de techniques simples.

Indicateurs de contamination dorigine fcale Coliformes totaux / fcaux (44C) / E. coli Dveloppement de nouveaux milieux

chromognes spcifiques de E. colignralisation de cet indicateur qui est un des plus sensibles et le plus spcifique

Entrobactries et coliformes totaux renseignent sur la matrise de lhygine gnrale

Streptocoques fcaux,plus rsistants dans le milieu, indicateurs du futur ?

Anarobies sulfito-rducteurs Clostridium:

htes normaux de lintestin Tellurique Dans les matires en putrfaction

Dnombrement sur Tryptone Sulfite Cyclosrine

Indicateur dhygine gnralePrsomption de la prsence de

Clostridium perfringens

Staphylocoques coagulase + S. aureus est la fois:

Germe pathogne car peut scrter une toxine Indicateur dhygine

Dnombrement sur glose de Baird-Parker (dia suiv) Vrifier lactivit coagulase + Si ncessaire,

recherche entrotoxines staphylococciques = critre de scurit pour les produits laitiers

K

Staphylococcus aureus sur glose Baird-Parker (jaune duf + tellurite)

colonies de staph. noires, entours dun halo + prcipit

Salmonella spp. Dangereux par simple prsence Principale source : origine fcale, contamination croise Recherche:

Pr-enrichissement Enrichissement sur bouillon au slnite ou au trathionate Isolement sur glose au vert brillant et rouge de phnol et une

autre glose ventuellement. J+3 : suspicion de prsence de Salmonelles J+4 : confirmation ou non par la galerie API

K

Critres de scurit des denres alimentaires critre dfinissant lacceptabilit dun produit

ou dun lot de denres alimentaires, applicable aux produits mis sur le march

Les rsultats des analyses : rvlent la qualit microbiologique du lot contrl. peuvent aussi tre utiliss pour dmontrer lefficacit

de lapplication du systme HACCP ou des bonnes pratiques dhygine dans le cadre du procd.

Critre microbiologique pour un aliment Elments pris en compte

Un critre microbiologique permet de s'assurer qu'un aliment est acceptablecompte tenu du nombre de bactries prsents.

Il se compose des lments suivants: Microorganismes /toxines indsirables Mthodes d'analyse pour les dtecter / les quantifier Plan dchantillonnage (Nb prlevts, taille chantillon) Limites microbiologiques juges appropries l'aliment Nombre d'units qui doivent tre conformes aux limites. Un critre microbiologique doit galement stipuler l'aliment

et le stade de la chane auxquels il s'applique, et les mesures prendre lorsqu'il n'est pas satisfait.

Source FAO: http://www.fao.org/docrep/w6419f/w6419f05.htm

Produits mis sur le marchpendant leur dure de conservation

EN/ISO 6579 2006 Absence dans 10 g

partir de 2010

Absence dans 25 g

0 5 Salmonella1.5 Viande hache et prparations de vde de volailles destines tre consom. cuites

Produits mis sur le marchpendant leur dure de conservation

EN/ISO 6579 Absence dans 25 g

05 Salmonella 1.4 Viande hache et prpa de viande destines tre consom. crues

Mmcn

Stade d'appli-

cation du critre

Mthode d'analyse

de rfrence3

Limites2 Plans d'chantil-lonnage1

Micro-organismes

/ toxines, mtabolites

Catgorie de denres

alimentaires

Plan dinterprtation 2 classes : satisfaisante / insatisfaisante

K7

Si non satisfaisant, aliment NON commercialis, et mme RAPPEL si dj mis en vente

Critres dhygine des procds critre indiquant lacceptabilit du fonctionnement du procd

de production. Un tel critre nest pas applicable aux produits mis sur le march. Il fixe une valeur indicative de contamination dont le dpassement exige des mesures correctives destines maintenir l'hygine du procd conformment la lgislation sur les denres alimentaires.

Viandes et produits base de viande Lait et produits laitiers Ovoproduits Produits de la pche Lgumes, fruits et produits base de lgumes et de fruits

Interprter un Plan trois classespour tester lhygine des procds Une troisime classe acceptable se glisse

entre satisfaisant et non satisfaisant On* dfinit deux limites microbio (m seuil bas et

M seuil haut): on acceptera que quelques chantillons se trouvent entre les deux

Le plan dchantillonnage dfinira donc le nombre de prises dchantillons n et le nombre acceptable entre les deux limites c

* On cest le rglement CE 2073/2005, qui dit : n = nombre d'units constituant l'chantillon; c = nombre maximal de rsultats pouvant prsenter des valeurs comprises entre m et M, pour le nombre d'chantillons n ralis

Amliorer hygine de production et slection matires premires

Fin du procdde fabri-cation

ISO 16649-1 ou 2

5000ufc/g ou

cm2

500ufc/g ou

cm2

25 E. coliPrparations de viande

Mmcn

Action en cas de

rsultats insatisfaisa

nts

Stade d'appli-

cation du critre

Mthoana-

lyse de rf-rence

Limites Plan chan-tillon-nage

Micro-organis-

mes

Catgorie de denres

alimentaires

Plan dinterprtation 3 classes : satisfaisant / acceptable / insatisfaisant

C, nombre maximum de rsultats pouvant prsenter des valeurs comprises entre m et M, pour le nombre dchantillons n ralis.

Prlvements sur carcasse

Lieux de prlvements

Cuisse

Flanc

Epaule

Collier

4 sites sur 5 carcasses x 10 semainesMontre hygine abattoir

Amliorer lhygine de labattage et rexamen des contrles de procd

Carcasses aprs lhabillage, mais avant le ressuage

ISO 21528-2

2,5 log ufc/cm2

1,5 log ufc/cm2moyen quoti-dien

Entrobactries

Amliorer lhygine de labattage et rexamen des contrles de procd

Carcasses aprs lhabillage, mais avant le ressuage

ISO 4833 5,0 log ufc/cm2

3,5 log ufc/cm2 moyen quoti-dien

Nombre de colonies arobies

Carcasses de bovins, dovins, de caprins et dquids4

Mmcn

Action en cas de rsultat

inacceptable

Stade d'applica-

tion du critre

Mthode d'ana-lyse de

rf-rence3

LimitesPlan d'chan-tillonnag

e

Micro-organismes

Catgorie de denres

alimentaires

Plan dinterprtation 3 classes (sur moyenne des log)satisfaisant / acceptable / inacceptable

CARCASSES

Examens Bactriologiques sur CarcassePour vrifier et amliorer lhygine de labattoirPour quelles autres raisons ?

Abattage animal accident Contrle officiel si doute

Septicmie ou Tuberculose ? Substance antimicrobienne ? (pvt = rein)

Vto Inspecteur peut le demander pour aide la dcision

Carcasse garde en consigneSi deuxime examen dfavorable = saisie totale

Questions d'interro possibles (exemples)- Quels sont les 2 types de critre microbiol. dfinis par la rglementation europenne ? Que signifient-ils? Donner pour chacun d'entre 2 exemples de bactries concernes - Citez 4 bactries ou toxines recherches dans les critres microbiologiques de scurit- Diffrences entre dnombrements bactriens en milieu liquide et en milieu solide, avantages-inconvnients, et type de rsultat obtenu (on peut faire un schma)- Sur un exemple de numration en milieu solide (donn sur le sujet), trouver le nombre de bactries par gramme d'aliment, et exprimez-le de faon standard- Quelle bactrie et/ou famille de bactries utilise-t-on en gnral comme indicateur de contamination fcale ? Donner trois facteurs qui permettent de slectionner/distinguer cette bactrie/famille lors de sa numration sur boite de ptri -Combien de temps faut-il pour dtecter et confirmer la prsence de Salmonelle dans un aliment ?- Quels sont les diffrents lments pris en compte pour dfinir un critre microbiologique ? - Diffrences entre plan 2 classes et plan 3 classes- Que fait lindustriel qui constate lors dun auto-contrle quun aliment quil commercialise nest pas satisfaisant pour un critre microbiologique de scurit des aliments ?- Que signifie "Plan 3 classes" pour l'interprtation des rsultats de l'analyse bactriologique d'un lot d'aliment ? Dfinissez m, M, n et c.- Comment contrle-t-on la qualit bactriologique des carcasses dans un abattoir ? - Interprter les rsultats d'une analyse microbiologique (sur un exemple). Le plan rglementaire d'interprtation sera donn sur le sujet d'exam : inutile de le savoir par cur !