Techniques de base de la vitroculture

S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales

Techniques de base de la vitroculture

Vitroculture et vitrométhodes


Aspects techniques

Organisation du laboratoire

Préparation des milieux et

stérilisation

Repiquage en conditions

stériles

Chambre de culture

Laverie


S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Conditions de culture



Stérilisation des explants

Ethanol Hypochlorite de sodium ou calcium Peroxyde d’hydrogène Nitrate d’argent

Protocole de stérilisation des explants végétaux

Choix del ’échantillon

1/ Ethanol 10 s2/ Ca(OCl)2 7%, 10 mn3/ 3 lavages H2O stérile

Découpage de l’explantet mise en culture


Milieu de culture

Eau

Agents solidifiants : – agar– phytagel :

polymère d’origine bactérienne (acide glucuronique, rhamnose et glucose)

translucide !! Interférences avec la kanamycine !!

Conditions de culture


Milieu de culture

Source de carbone


?In vitro, la majorité des cultures végétales

sont hétérotrophes

Choix de la source carbonée•Saccharose•glucose•maltose

Cas par cas : •substances de croissance

•génotype


Milieu de culture

Éléments minéraux

Macroéléments : N,P,K, Ca, Mg, S ex : rapport NO3

- / NH4

+

Microéléments : autres oligoéléments


Utilisation de nitrate d’argent comme antagoniste de l’éthylène


Substances de croissance

Auxines (dérivés du tryptophane) Cytokinines (dérivés de l’adénine) Gibbérellines (diterpènoïdes)



Les auxines


Naturelle :•Acide Indole Acétique = IAA N

CH2 CO2 H

HCH2 CO2 H

Synthétiques :•Acide Naphtalène Acétique

•2,4-D (acide dichlorophenoxyacétique)

OCH2 CO2 H

Cl

Cl


Mode de production des auxines Site de production:bourgeon apical

Diffusion des hormones- dominance apicale- stimulation de la rhizogenèse



Au niveau cellulaire : elles stimulent l’élongation

Au niveau tissulaire : Elles stimulent la croissance racinairepour de faibles concentrations (sauf le 2,4-D)

Rôle des auxines

Elles inhibent l’élongation de la tige feuillée et le débourrement des bourgeons axillaires




Les cytokinines– Naturelles

Isoprénoïd CK (ex: zéatine) Aromatic CK (ex: BA)


Synthétiques •Kinétine•Benzyl AdénoPurine (BAP)


Mode de production des cytokinines

Site de production:Racines

Transport vers lessites d ’action :- levée de dominanceapicale- débourrement desbourgeons axillaires


Au niveau cellulaire : elles stimulent la division cellulaire via l’induction de Cyclines

Au niveau tissulaire : En général, inhibition de la croissanced’apex racinaires

Induction de l’activité des méristèmes apicaux des organes aériens

Rôle des cytokinines

Surexpresseur de CYCD3Riou-Khamlichi et al., 1999 Science

Expression de CYCD3 en fonction des traitements hormonaux chez A.thaliana



Gibbérellines (Acide gibbérellique)– Noyau ent-Kaurène (issu du geranyl-geranyl PP)



Gibbérellines (Acide gibbérellique)– Effets complexes :

Stimulation croissance internodale, expansion des feuilles Inhibition de la croissance racinaire à la lumière Favorise au contraire la croissance racinaire à l’obscurité


Milieu de culture

Éléments organiques divers

Acides aminés (glycine, cystéine…)

Vitamines (thiamine, acide nicotinique, acide folique…)

Mélanges organiques complexes

Antioxydants



Comment obtenir un calet des cellules indifférenciées ?

Cellules indifférenciées

Coupure

callogenèse

S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales callogenèse




S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales organogenèse


Organogenèse

Régénération d’organes à partir d’un cal

Skoog et Miller (1957)

[Auxine]

[Cytokinine]

Callogenèse

Rhizogenèse

Cau

loge

nèse


Méthode classique– 1 – Explants sur un milieu inducteur de cal = CIM– 2 – Transfert quelques jours plus tard sur un milieu

inducteurs de tiges feuillées = SIM– 3 – Transfert après quelques semaines sur un

milieu inducteur de racinesPour un exemple détaillé lire l’article “classique” de Valvekens et al. 1987 PNAS sur la méthode d’Agrotransformation de racines d’Arabidopsis


Documents

Techniques de base de la vitroculture