Test de migration des CMLs humaines

But : étudier l’effet de l’ASIS dilué au 1/30 sur la migration des cellules musculaires lisses

humaines.

Matériels et Méthodes

Chimioatttractants

Les cellules sont testées sur chambre de Boyden avec une présence de différentes

concentrations de chimioattractant : PDGF et bFGF. Dans cette étude, la concentration du

PDGF sera de 10 ng/mL (appelé sPDGF) (déterminer par Ahmed) et celle du bFGF sera de

15 ng/ mL (appelé sbFGF).

La solution d’ASIS utilisée sera diluée au 1/30 (dilution déterminer auparavant) d’une

solution mère à 2540 µg/mL, donc la solution final utilisé sera de 84.6 µg/mL (appelé

ASIS30).

Nb : tout les chimioattractants sont dilués dans du HAM-F10+2%SVF (appelé milieu 2%)

Préparation de la suspension cellulaire

Les cellules utilisées sont des CML issues d’artère mammaire (CML 14(1) P5). Après

confluence sur 1 boite T75, les cellules sont sevrées 24 heures à 37°c avec 5 % de CO2 dans

un milieu HAM-F10 + 0.2 % de SVF + Antibiotiques.

Les cellules sont ensuite trypsinées puis reprises à 800000 cellules /mL dans du milieu 2 %

(appelé SolC).

Incubation des cellules dans l’ASIS

Nous allons travaillé sous 2 conditions : 1 groupe de cellule vont recevoir de l’ASIS à 84.6

µg/ml et un groupe avec du milieu 2 %.

Pour le Groupe ASIS, on prend 500 µL de la SolC + 500 µL d’ASIS30, incubation 10 min à

37 °C.

Pour le groupe milieu 2 %, on prend 500 µL de la SolC + 500 µL de milieu 2 %, et on incube

10 min à 37 °C.

Préparation de la chambre de Boyden

Sur une plaque 24 puits, on dépose dans chaque puit 1 chambre de Boyden stérilement à

l’aide d’une pince stérile. Au niveau de la chambre, on ajoute 100 µL des suspensions

cellulaires, ce qui fait 40000 cellules dans le puits. Dans le puit, on ajoute 500 µL de solutions

chimioattratantes.

Voici le schéma de plaque :

Groupe ASIS30 Groupe milieu 2 %

Milieu 2% Milieu 2% Milieu 2% Milieu 2% Milieu 2% Milieu 2%

sPDGF sPDGF sPDGF sPDGF sPDGF sPDGF

sbFGF sbFGF sbFGF sbFGF sbFGF sbFGF

Le tout est incubé 24 heures à 37 °C + 5 % de CO2

Marquage des cellules

Après incubation 24 heures, les chambres de Boyden sont retirées des puits, la surface haute

de la chambre est scrapée au coton tige. On effectue 2 lavages au PBS 1X, puis les chambres

sont fixées au PFA 4 % avant d’être marquées au DAPI et découpées pour la lecture en

fluorescence (UV).

Résultats

Les cellules migrantes sont lues à l’aide d’un logiciel (ImageJ) en libre accès. Les résultats

sont exprimés en nombre de cellule.

Groupe ASIS30 Groupe milieu 2 %

252 315 29 483 255

16 496 486 1244 1260

500 994 427 450 663 367

Il existe toutefois dans des résultats aberrants qui est peut être dû à la présence d’amas

cellulaire dans la suspension initiale ou à un problème de cellule. Il faut donc répéter une

autre fois l’expérience.