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TRAVAUX PRATIQUES DE GENETIQUE Mars 2017 · 2017-03-12 · germination des spores : ... Pour réaliser ce test de coloration sur une boîte de Pétri, ... Cette remarque est valable

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TRAVAUX PRATIQUES DE

GENETIQUE

Mars 2017

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OBJET DES T.P.

Les T.P. porteront sur la génétique d'un eucaryote unicellulaire, la levure Saccharomyces cerevisiae. Cette levure est responsable de la fermentation qui intervient dans la fabrication du pain, du vin et de la bière. Elle est aussi utilisée dans de nombreux laboratoires de recherche en tant que modèle expérimental pour l'étude des fonctions cellulaires propres aux organismes eucaryotes (cycle de division mitotique, trafic interne des protéines, organisation du cytosquelette, structure et réplication des chromosomes, etc..). La levure est un des organismes de laboratoire qui se prêtent très facilement aux analyses génétiques (voir cours théorique, chapitre "Dissection génétique des phénomènes biologiques"). La séquence complète du génome de cette levure (~ 12.500.000 pb) a été établie en 1996. Parmi les ~5600 gènes codant pour des protéines qui ont ainsi été répertoriés, une fraction importante demeure de fonction inconnue. Beaucoup de ces gènes inconnus sont conservés chez les organismes supérieurs, y compris chez l'homme.

Ces T.P. illustreront les lois fondamentales de la ségrégation des gènes au cours de la méiose, qui est la base de la génétique moderne. I. INTRODUCTION – Le Cycle de vie de la levure S. cerevisiae La levure se présente naturellement soit à l'état haploïde (n) (un seul jeu de 16 chromosomes), soit à l'état diploïde (2n) (deux jeux de chromosomes). Si les conditions nutritionnelles du milieu le permettent, une cellule n se reproduit de façon asexuée (multiplication végétative) par mitoses successives (Fig. 1). La mitose chez S. cerevisiae est d'un genre particulier puisque la cellule fille apparaît sous forme d'un bourgeon grossissant à la surface de la cellule mère, avant de s'en détacher. Il existe deux types de cellules haploïdes, notées "a" et "alpha". Une cellule "a" émet une phéromone "a" reconnue par un récepteur présent à la surface des cellules "alpha". Inversement, les cellules "alpha" émettent une phéromone "alpha" reconnue par les cellules "a". La détection réciproque des phéromones induit un phénomène complexe qui aboutit à la fusion (ou conjugaison) des cellules "a" et "alpha" en une levure diploïde (2n). Si les conditions nutritionnelles sont favorables, la cellule 2n se reproduit par division mitotique. Si les nutriments viennent à manquer, la levure 2n développe une division méiotique (sporulation). Les quatre cellules n issues de la méiose (spores, deux "a" et deux "alpha") restent enfermées au sein d'une asque (issue de la paroi cellulaire résistante de la cellule 2n mère). Dès que les conditions du milieu redeviennent favorables, on assiste à la germination des spores : l'asque se brise et les cellules n sont libérées dans le milieu, dans lequel elles vont se multiplier de façon végétative, et éventuellement fusionner pour former de nouvelles cellules 2n. L'expérimentateur peut contrôler toutes les phases du cycle de reproduction de la levure. Il peut cultiver séparément, de façon végétative, des cellules n de type "a" ou "alpha". Il utilisera pour cela soit un milieu riche (à base de lysats cellulaires), soit un milieu minimum de composition parfaitement définie. Il peut mélanger des cellules "a" et "alpha" et isoler de façon mécanique (à l'aide d'un micromanipulateur) une cellule 2n unique. Si cette cellule est placée sur un milieu riche, elle fondera un clone (ayant l’apparence d’une colonie à la surface du milieu gélosé) de cellules génétiquement identiques se reproduisant de façon végétative. Si la cellule 2n est placée sur un milieu de sporulation (carence en nutriments), elle développera une méiose et formera une asque. L'expérimentateur peut isoler mécaniquement une asque et la disséquer pour en extraire les quatre cellules n. Les quatre cellules n (issues du même

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événement méiotique) peuvent être isolées et cultivées séparément afin d'en étudier les propriétés phénotypiques.

Fig. 1. Cycle de vie de la levure Saccharomyces cerevisiae

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2. PROTOCOLES 1. Composition des milieux gélosés - Milieu riche (codifié 868) : ce milieu est à base d’hydrolysats (Yeast extract, Bactopeptone), donc riche en acides aminés, et contient du glucose (conc. finale de 2%). Des boîtes de milieu avec ou sans antibiotique (G418, également appelé généticine) seront fournies - Milieu minimum gélosé (codifié 167) et nutriments: ce milieu minéral est une solution de MgS04, KH2PO4, CaCl2, NaCl, K2SO4 mis à pH 6.1 par du citrate et du KOH. Des fioles de 500 ml de ce milieu minimum 167 seront fournies. A ces milieux, vous devez ajouter une source d’azote, une source de carbone et d’énergie, des vitamines et des métaux (les autres nutriments, comme le soufre, le phosphate, … sont présents dans le milieu 167). Si l’un de ces nutriments manque, aucune croissance n’est possible. De plus, il est parfois nécessaire d’ajouter des composés compensant les auxotrophies des souches de levure ou des composés toxiques. Il faut donc ajouter dans la fiole de 500 ml de milieu minimum : 50 ml d’un mélange contenant du glucose 30%, des vitamines concentrées 10x et des métaux concentrés 10x. Source d’azote : variable selon l’expérience, donc à rajouter dans la boite de Pétri : (NH4)2S04 : concentration finale de 10 mM (donc 20 mM en NH4

+) GABA (acide g-aminobutyrique): concentration finale de 10 mM Additifs pour la compensation des auxotrophies : uracile : 0,4 mM de concentration finale histidine : 0,5 mM de concentration finale tryptophane : 0,5 mM de concentration finale leucine : 0,8 mM de concentration finale Analogue toxique : b-(2-thienyl)-DL-alanine : concentration finale de 20 et 40 µg/ml (2 boites) (la source d’azote du milieu sera l’ NH4

+) 2. Préparation des boîtes de milieu gélosé Avant toute chose, prenez soin d'indiquer sur vos boîtes (pas sur les couvercles) le n° de votre binôme, de l'expérience, et la composition du milieu. Assurez-vous que votre milieu contient les nutriments nécessaires. Le milieu sera coulé à chaud (à peine sorti du bain à 60°C). Avant de couler le milieu, disposez dans les boîtes vides, à l'aide de micropipettes, les quantités calculées des solutions d'additifs et d’azote. Les quantités ajoutées aux boites seront calculées en tenant compte qu'une boîte de Pétri à moitié remplie contient environ 20 ml de milieu (l'erreur introduite dans la quantité de milieu réellement versée dans la boite n'influencera pas les résultats des tests de croissance). Directement après avoir rempli une boîte de milieu, homogénéisez celui-ci par un léger mouvement de rotation de la boîte maintenue sur la table. Une fois le milieu solidifié, séchez les boîtes (ouvertes) dans la hotte à flux stérile pendant une heure (pour les répliques par tampon de velours) ou 20 minutes (pour les répliques à l’aide de la « bête à pattes »).

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3. Répliques : Par tampon de velours (expériences 1 et 4) Indiquez un repaire d'orientation sur la boîte mère et sur les boîtes filles. La surface du velours doit être plane (velours bien tendu). Avec un même velours, on peut réaliser l’ensemble des répliques (de l’exp. n°1) si les boites ne sont pas humides (séchage sous hotte pendant une heure). Par la « bête à pattes » (expériences 2 et 3) Indiquez un repaire d'orientation sur les boîtes filles. On effectue une dilution des cellules dans une microplaque 96 puits et on réalise les répliques. 4. Test de coloration des colonies lacZ+ sur boîte Des cellules exprimant la b-galactosidase sous contrôle du promoteur du gène AGP1 (cf. Fig. 2) peuvent être facilement repérées sur une boite de Pétri de milieu minimum (avec de l’ammonium comme source d’azote) par un test de coloration basé sur l’X-gal (substrat chromogénique de la b-galactosidase) à condition d’ajouter au milieu un acide aminé inducteur d’AGP1. Pour réaliser ce test de coloration sur une boîte de Pétri, suivez la procédure suivante : - Ajoutez dans un tube de 50 ml ; volume donné pour une boite de Petri

5 ml de tampon phosphate de Na 1M pH 7,2, homogénéisez 0,2 ml de SDS 10 %, homogénéisez délicatement (éviter les bulles) 0,1 ml de X-gal 20 %, homogénéisez

- Ajoutez ce mélange à 5 ml d’une solution d’agarose 1% chauffée préparée par les assistants - Versez délicatement à la surface du milieu gélosé mais à côté des colonies et observez

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3. EXPERIENCES DE GENETIQUE Expérience n°1 : analyse de 12 méioses Deux souches n de levure (A et B) de génotypes différents 1 ont été croisées :

- souche A : MAT a, ura3, leu2, his3, trp1, YCL012C+ - souche B : MAT alpha , ura3, LEU2+, HIS3+, TRP1+, ycl012cD[GenetR] Mutation ura3 : affecte le gène URA3 (chr V) codant pour l'orotidine-5'-phosphate décarboxylase, une enzyme impliquée dans la biosynthèse de l'uracile. Mutation leu2 : affecte le gène LEU2 (chr. III) codant pour la 3-isopropylmalate déshydrogenase, une enzyme qui catalyse une étape de la biosynthèse de la leucine. Mutation his3 : affecte le gène HIS3 (chr. XV) codant pour l'imidazole-glycérolphosphate (IGP) déshydratase, une enzyme nécessaire à la biosynthèse de l'histidine. Mutation trp1 : affecte le gène TRP1 (chr. IV) codant pour la phosphoribosylanthranilate isomérase, une nécessaire à la biosynthèse du tryptophane. ® Ces différentes mutations induisent une auxotrophie : pour croître sur un milieu minimum défini, les mutants doivent pouvoir prélever du milieu le composé qu'ils sont incapables de synthétiser. Mutation ycl012cD[GenetR] : l'ORF du gène YCL012C de fonction inconnue (gène orphelin) a été remplacée par un gène conférant la résistance à l'antibiotique généticine (ou G418). Cette résistance est bien marquée sur milieu riche (868) (les boîtes de milieu 868 et 868 + G418 sont fournies). Après croisement, un zygote unique a été isolé à l'aide d'un micromanipulateur. Cette cellule 2n a développé une colonie sur un milieu. Des cellules de cette colonie ont été prélevées à l'aide d'un fil de platine et transférées sur un milieu induisant la sporulation. Après quelques jours, plusieurs asques ont été isolées et disséquées pour en extraire les quatre ascospores. Ensuite, ces différents ensembles de quatre ascospores, les deux souches parentales (A, B) et la souche diploïde (notée AB) ont été disposées sur deux boites de Pétri de milieu riche sans antibiotique. Ces deux boites sont mises à votre disposition. A l'aide de la technique des répliques par tampon de velours, vous allez réaliser des empreintes de ces boîtes sur différents milieux minimum 2 dont vous aurez d'abord défini la composition afin de pouvoir déterminer : a) le génotype des différents clones, et ce pour l'ensemble des gènes considérés : URA3, LEU2, HIS3, TRP1 et YCL012C

b) si les caractères "incapacité de synthétiser la leucine", "incapacité de synthétiser le tryptophane", et "résistance à l'antibiotique G418" sont dominants ou récessifs. Commentez votre réponse, le résultat obtenu vous paraît-il attendu ?

c) si la ségrégation des caractères que vous avez examinés est indépendante. Commentez votre réponse en mettez-là en relation avec les informations disponibles dans la base de données SGD (Saccharomyces Genome Database).

d) choisissez deux tétrades différentes (dont celle qui vous paraît la plus intéressante à illustrer) et pour chacune d’elle réalisez un schéma représentant les deux divisions successives de la méiose qui aboutissent à ces tétrades. Vous représenterez surtout les chromosomes sur lesquels vous positionnerez trois gènes : le gène YCL012C et deux autres de votre choix. Prenez bien en compte le fait qu’il y a toujours au moins un crossing-over entre les deux chromosomes homologues lors de la méiose.

1 Conventions d’écriture : LEU2 : gène sauvage, leu2 : mutant (récessif) 2 N’oubliez pas de prévoir des « boites de contrôle » pour que le résultat de chaque « boite test » puisse être correctement interprété. Cette remarque est valable pour chaque expérience du TP

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Expérience n°2 : étude de la mutation "x" affectant l'expression des gènes UGA L'acide g-aminobutyrique (GABA) est un acide aminé que la levure peut utiliser comme source unique d'azote. En présence de GABA dans le milieu, on assiste à l'induction de la transcription des gènes codant pour la perméase du GABA (UGA4, chr. 4) et les enzymes du catabolisme du GABA (UGA1 du chr. 6 et UGA2 du chr. 2). Cette induction transcriptionnelle est assurée par un activateur transcriptionnel codé par le gène UGA3 (chr. 4). Ce dernier n'est pas induit par le GABA, il s'exprime en permanence. Un mutant uga3 ura3 (souche E) est incapable de croître sur un milieu minimum contenant du GABA comme source unique d'azote (milieu GABA), car les gènes impliqués dans le catabolisme du GABA ne sont pas induits. A partir du mutant uga3 ura3, un nouveau mutant a été isolé qui a retrouvé la capacité de croître sur le milieu GABA (souche F). Ce mutant porte une mutation suppressive, que nous appellerons provisoirement "x". Il a ensuite été observé que dans le mutant uga3 x ura3, l'expression des gènes du catabolisme du GABA est constitutive : ces gènes sont exprimés aussi bien en absence qu'en présence du GABA. Pour en savoir plus sur cette mutation "x", le mutant uga3 x ura3 a été croisé avec une souche ura3 (souche H). Un zygote a été isolé, mis en culture sur le milieu riche, et ensuite transféré sur le milieu de sporulation. Plusieurs asques ont été disséquées pour en isoler les ascospores. Celles-ci ont été disposées sur une boîte de milieu riche, mise à votre disposition. Les souches E, F, H et la souche diploïde (FH) sont également présentes sur la boîte. A l'aide de la technique de la « bête à pattes », réalisez des empreintes de la boîte originale sur un milieu minimum vous permettant de distinguer les cellules capables ou pas d’exprimer les gènes UGA, et sur au moins un milieu contrôle de l’efficacité de la réplique. Décrivez les résultats de ce test. Que pouvez-vous conclure à propos de la mutation "x" ? Quel modèle proposez-vous pour expliquer l’effet de la mutation "x" ? rem : notez bien que toutes les souches sont ura3, n’oubliez pas d’en tenir compte quand vous préparez vos boites ! Expérience n°3 : étude de la mutation "y" conférant une résistance à un analogue d'acide aminé La membrane plasmique de la levure Saccharomyces cerevisiae dispose d’un senseur capable de détecter la présence d’acides aminés dans le milieu extracellulaire et d’activer une voie de signalisation qui aboutit à l'activation des facteurs transcriptionnels Stp1 et Stp2. Cette activation se produit par une réaction de clivage (catalysée par une protéase) qui a pour effet d’éliminer leur domaine N-terminal de rétention cytoplasmique. Une fois clivés, Stp1 et Stp2 migrent du cytoplasme vers le noyau où ils activent la transcription des gènes d’une série de perméases d’acides aminés dont AGP1 et BAP2, choisis comme gènes de référence pour étudier cette voie de signalisation. Les facteurs Stp1 et Stp2 sont redondants, ce qui signifie qu’il suffit qu’un seul des deux soit fonctionnel pour que la transcription des gènes de perméases soit normalement induite.

Des travaux antérieurs ont abouti au modèle selon lequel le senseur des acides aminés externes serait constitué d’un complexe de trois protéines: Ssy1, similaire aux perméases d’acides aminés, et Ptr3 et Ssy5, deux protéines hydrophiles associées à la périphérie cellulaire. Ssy5 est la protéase qui clive les facteurs Stp1 et Stp2. Les mutants ssy1, ptr3, et ssy5 présentent un phénotype facilement détectable sur boîte de Pétri de milieu minimum contenant de l’ammonium comme source d’azote: ils sont résistants à la b-(2-thienyl)-DL-alanine, un analogue toxique d’acides aminés. Ceci est dû au fait que la perméase Bap2 qui permet l’entrée de ce composé toxique dans la cellule n’est pas synthétisée dans ces mutants (car son gène ne s’exprime plus).

De nouveaux mutants résistants à la b-(2-thienyl)-DL-alanine ont été isolés à partir d’une souche ura3 (souche I). Un des ces mutants, que nous appellerons provisoirement y (souche J, ura3 y), sera analysé dans cette 3ème expérience. Nous souhaitons déterminer si l’expression du gène AGP1 est déficiente dans cette souche. Pour ce faire, le mutant a été croisé à une souche ura3 dans laquelle la région codante du gène AGP1 a été remplacée par celle de lacZ codant pour la b-galactosidase de E. coli (Fig. 2) (souche K). Dans cette dernière souche, l’enzyme b-galactosidase n’est synthétisée que si les

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cellules sont cultivées en présence d’acides aminés (par ex. la leucine, un des inducteurs les plus efficaces de l’expression du gène AGP1). Après sporulation du diploïde ainsi isolé, des ascospores ont été isolées. A l'aide de la technique de la « bête à pattes », et de celle qui permet de distinguer les levures exprimant on non la b-galactosidase (cf. protocole 4), déterminer si la mutation y empêche l’expression du gène AGP1.

Fig. 2. Schéma du remplacement de la région codante du gène AGP1 par le gène lacZ de E. coli. Le gène lacZ est accompagné en 3’ d’un gène Genet R (ou kanMX) qui confère aux levures une résistance à la généticine, un antibiotique. Le fragment intégratif d’ADN est obtenu par une réaction de PCR. Les séquences de 40 pb bordant la cassette intégrative sont identiques aux séquences situées juste en amont et en aval de la région codante du gène AGP1. C’est ce qui permet l’intégration ciblée (par recombinaison homologue) du fragment d’ADN. Expérience n°4 : test de complémentation Comme indiqué plus haut, de nouveaux mutants résistants à la b-(2-thienyl)-DL-alanine ont été isolés au laboratoire. L’expérience n°3 permet de déterminer si ces mutants présentent un défaut d’induction du gène AGP1 en réponse aux acides aminés. Si c’est le cas, le mutant pourrait porter une mutation dans les gènes SSY1, PTR3, SSY5 ou dans un autre gène indispensable à l’induction du gène AGP1 qui n’aurait pas encore été identifié. Dans cette 4ème expérience, vous réaliserez un test de complémentation entre d’une part quelques-uns des mutants isolés (notés y1 à y5), tous de signe sexuel "alpha", d’autre part des souches mutantes ssy1, ptr3 et ssy5, toutes de signe sexuel "a". Dans ces souches mutantes "a", la région codante du gène AGP1 a été remplacée par le gène lacZ, comme illustré à la Figure 2, mais ce gène ne peut s’exprimer car les mutations dans ces souches l’en empêchent. En croisant les mutants résistants à la b-(2-thienyl)-DL-alanine aux trois souches mutantes agp1::lacZ, vous pourrez en principe déterminer si les mutants nouvellement isolés sont porteurs d’une mutation dans les gènes SSY1, PTR3 ou SSY5. Les souches à croiser de même signe ont été disposées en lignes parallèles sur deux boites de milieu gélosé (boite de souches "a" et boite de souches "alpha"). Imaginez un moyen simple basé sur la technique des répliques par tampon de velours et la technique de coloration pour détecter la b-galactosidase afin de croiser les différentes souches et déterminer si les diploïdes qui se formeront dans chaque cas sont capables ou non d’induire la transcription du gène AGP1 en présence d’acides aminés. Réalisez ensuite l’expérience, examinez et interprétez les résultats, et tirez vos conclusions.

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Expérience n°5 : construction d'un gène chimérique GAP1-GFP. Le gène GAP1 3 (General Amino-acid Permease 1) de la levure code pour une perméase capable de catalyser l’entrée de n’importe quel acide aminé dans la cellule. La transcription de ce gène est régulée en fonction de la richesse en azote du milieu. On souhaite détecter la protéine Gap1 dans des cellules vivantes par microscopie à fluorescence. Pour ce faire, l’extrémité 3’ de la région codante du gène GAP1 sera fusionnée à la région codante du gène de la « Green Fluorescent Protein » (GFP). Le gène GAP1 ainsi remanié va donc coder pour une protéine hybride, Gap1-GFP 4. Un moyen commode chez la levure pour construire ce type de gène consiste à amplifier par PCR un fragment d’ADN codant pour la GFP. Ce fragment comporte également le gène GenetR conférant aux cellules qui vont intégrer ce fragment la capacité de résister à un antibiotique, la généticine (Fig. 3). Ce fragment d'ADN, une fois introduit dans la levure, doit s'intégrer par recombinaison homologue au niveau du gène GAP1, comme représenté dans la Figure 3. Pour que l'intégration se produise à cet endroit, la PCR a été conçue de telle manière que le fragment soit bordé de séquences de 40 pb (en grisé dans la Fig. 3) identiques aux sites d’intégration souhaités (Fig. 3). Ces séquences correspondent aux 40 nucléotides précédant le codon stop du gène GAP1 (du côté de la GFP) et aux 40 nucléotides situés 120 nucléotides après le codon stop. Les cellules de levure sont transformées par ce fragment d’ADN et les cellules ayant intégré le fragment dans leur génome sont sélectionnées pour leur résistance à la généticine.

Fig. 3. Schéma de l’insertion du gène de la GFP (accompagné en 3’ d’un gène GenetR ou KanMX conférant la résistance à la généticine ou G418) à l’extrémité 3’ de la région codante du gène GAP1

3 Locus YKR039w (http://www.yeastgenome.org/) 4 En fait, une séquence formée de la répétition du dipeptide glycine-alanine fait la jonction entre l’extrémité C-terminale de la protéine Gap1 et l’extrémité N-terminale de la protéine GFP.

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Cette transformation a été réalisée et de nombreuses colonies résistantes à la généticine ont été obtenues. Nous avons récupéré ces colonies de levure et en avons extrait l’ADN total. Chaque binôme va recevoir l’ADN extrait à partir d’une colonie. Vous allez utiliser cette préparation d’ADN comme ADN matrice d’une réaction de PCR qui vise à déterminer si le gène de la GFP s’est correctement intégré à l’extrémité du gène GAP1 ou pas (le gène pourrait éventuellement s’être intégré ailleurs dans le génome). On met à votre disposition 4 oligonucléotides correspondant à des séquences du gène GAP1 (GAP1-O1, -O2, -O3, -O4) et deux autres correspondant au gène GenetR (5K, 3K). Ces oligonucléotides sont indiqués dans les fichiers "Ape" mis à votre disposition. Vous devez choisir les oligonucléotides qui vous permettront de répondre sans ambigüité à la question posée. Attention, l’absence d’amplification après une PCR n’est pas à elle seule une réponse valable (vous comprenez pourquoi ?), c'est pourquoi on vous recommande de réaliser deux réactions de PCR afin de tester les différentes éventualités.

Protocoles d’expériences

1. PCR pour vérifier l’insertion de la cassette GFP-KanMX ATTENTION : travailler avec des gants ! Dans un tube PCR, ajoutez dans l’ordre : 35,5 µl d’eau

10 µl de tampon PCR 5X 1 µl dNTP 10 mM 1 µl amorce ? (25 pmoles/µl) 1 µl amorce ? (25 pmoles /µl) 1 µl de solution d’ADN extrait --------- 49,5 µl

- Placez dans la glace en attendant que l'ensemble des réactions de tous les binômes soient prêtes. - Ajoutez 0,5 µl Taq DNA Polymérase (5 unités/µl). Réalisé par un assistant du TP - Disposez les tubes dans l'appareil de PCR : Programme : 1X 94°C 30 sec 30X 94°C 30 sec 52°C 30 sec 68°C 150 sec 1X 68°C 5 min

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2. Analyse du produit de la réaction de PCR par électrophorèse en gel d’agarose La photo du gel vous sera remise. Utilisez cette dernière et la fiche technique du marqueur de poids moléculaire pour analyser votre produit de PCR.

Pour le rapport

• Indiquez la séquence des différents oligonucléotides mis à disposition (tous, y compris ceux qui n’ont pas été utilisés) en respectant les conventions d'écriture.

• Justifiez le choix des oligonucléotides utilisés dans vos réactions de PCR. • Donnez la taille théorique des fragments PCR attendus (en nombre de paires de bases) et la

taille des fragments d’ADN observés sur gel. • Discutez les résultats et les éventuels problèmes rencontrés. • Concevez les oligonucléotides utilisés pour amplifier la cassette GFP-GenetR à partir du

vecteur pFA6a-GA5-GFP(S65T)-kanMX6. Indiquez sur vos oligonucléotides les différentes parties et à quoi elles correspondent.