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UE3. S5 – Biochimie clinique, Nutrition, Métabolisme Pr. Guiraud Date : 18/09/2017 Plage horaire :9h30-12h30 Promo : DFGSM3 17/18 Enseignant : P Guiraud Ronéistes : PEEROO Deen /BALLINI Romeo CEBELIEU Claire /LERUSTE Philomène Les Dosages Biologiques En Biochimie Clinique I. La phase Pré-analytique 1)La prescription 2)Les conditions de prélèvement 3)Le matériel à disposition II. Le prélèvement 1)Les tubes de prélèvement 2)les anticoagulants III. Fiabilité de l’analyse IV. Situations physiologiques - habitudes du patient V. Autres paramètres importants lors de la phase pré-analytique VI. L’enregistrement des données /31 1

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UE3. S5 – Biochimie clinique, Nutrition, Métabolisme Pr. Guiraud

Date : 18/09/2017 Plage horaire :9h30-12h30 Promo : DFGSM3 17/18 Enseignant : P Guiraud

Ronéistes : PEEROO Deen /BALLINI Romeo CEBELIEU Claire /LERUSTE Philomène

Les Dosages Biologiques En Biochimie Clinique

I. La phase Pré-analytique 1)La prescription 2)Les conditions de prélèvement 3)Le matériel à disposition

II. Le prélèvement 1)Les tubes de prélèvement 2)les anticoagulants

III. Fiabilité de l’analyse

IV. Situations physiologiques - habitudes du patient

V. Autres paramètres importants lors de la phase pré-analytique

VI. L’enregistrement des données

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Protéines sériques / plasmatiques

I. Introduction : les fonctions du sang

II. Distinction Sang / Plasma / Sérum 1) Sang total 2) Plasma vs sérum 3) Composition du sang et du plasma 4) Fonctions des composés du plasma

III. Les dosages 1) Les dosages selon leurs indications : exemple de la βhcg 2) Les dosages en biochimie

a. Le ionogramme plasmatique b. Protéine totale et albumine c. Les enzymes hépatiques d. La bilirubine Totale e. Autres f. Les marqueurs cardiaques g. L’électrophorèse des protéines h. La CRP

IV. Protéines plasmatiques 1) Origine, fonction, variations des protéines 2) Principe de dosage 3) Dosages

a. Albumine sérique b. Transferrine c. Pré-albumine sérique d. Retinol Binding Protein

V. Protéines sériques 1) Méthodes d’études 2) Electrophorèse 3) Principales situations pathologiques

a) Inflammation b) Insuffisance hépatique c) Syndrome néphrotique d) Déficit immunitaire e) Immunoglobuline polyclonale VS monoclonal

VI. Conclusion

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Les Dosages Biologiques biochimie clinique

Ce qu’on appelle la biologie ou biochimie clinique concerne tous les secteurs de la médecine. Les principaux secteurs concernés sont : -Biochimie, Hématologie, Virologie, Bactériologie, -Immunologie, Parasitologie, Génétique, -Anatomo-pathologie, Cancérologie -Pharmacologie-Toxicologie, Addictologie

Il existe plus de 400 examens différents touchant l’un ou l’autre de ces secteurs.

Dans ces dosages, on va essayer de suivre l’évolution d’un marqueur avec des valeurs dîtes physiologiques et des valeurs d’ordre pathologique qui sortent des fourchettes que représentent ces valeurs normales.

! Les milieux dans lesquels on réalise ces dosages sont très variés. Les liquides biologiques sont en générale les échantillons utilisés, surtout le sang et l’urine. Mais il existe d’autres milieux biologiques dans lesquels on peut rechercher des marqueurs : les sucs gastriques, le liquide céphalo rachidien (LCA), liquide pleural, liquide synovial, biopsie, selles…

Ces dosages ont une valeur diagnostique dans certains cas, ils peuvent être aussi utile pour la surveillance de traitement, à faire du dépistage, on encore avoir une valeur pronostic.

On distingue des examens de base, dit de routine fait en milieu hospitalier ou pour des patients suivis en ville.

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On a aussi des examens beaucoup plus spécialisés s’intéressant à des pathologies très particulières. Quand on fait ce genre de dosage, tout un encadrement est mis en place afin de pouvoir contrôler les résultats. I. La phase Pré-analytique

Cette phase comprend :

1) La prescription qui doit comporter toutes les informations utiles concernant le patient

2) Les conditions de prélèvement : volumes nécessaire à l’exécution de l’analyse + sérothèque éventuellement, le choix du matériel de recueil et les conditions de transport vers le laboratoire (température, protection à la lumière etc.)

3) Le matériel à disposition :

. Tubes en verre : référence mais peut se casser et va avoir tendance à activer la coagulation (on peut utiliser des verres siliconé pour réduire cette effet)

. Tubes en plastique : peu étanche, risque d’adsorption de certains composés du sang pouvant fausser les résultats. Les tubes doivent être utilisé dans les 30j après ouverture de l’emballage s’ils possèdent des anticoagulants (sinon on peut entraîner des variations sur le temps de Quick par exemple)

. Sérum : C’est le surnageant du sang total après que le processus de coagulation se soit effectué. Il n’y a donc plus de facteurs de coagulation (donc si c’est ce qui nous intéresse on choisira le plasma). Il contient des composés intracellulaires provenant notamment des plaquettes et de leur activation, ce qui peut être un artéfact dans certains dosages. Malgré tout le sérum reste très utilisé pour un certain nombre de dosage.

. Plasma : C’est le surnageant acellulaire obtenu par centrifugation du sang total, dont la coagulation a été inhibé par la présence de substances anticoagulantes. Il contient donc des anticoagulant (pouvant fausser les résultats dans certaines technique) et les facteurs de coagulations.

. Anticoagulants : Les héparines, l’EDTA ou le citrate, on peut donc en retrouver dans les échantillons sanguins après prélèvement

. Les inhibiteurs de la glycolyse : le fluorure de sodium et le mono-iodacétate, pour les prélèvements avec dosage de glycémie (si retard à l’exécution du dosage) mais non utilisable pour les autres paramètre (Na ; Ca)

. Les gels séparateurs : Permettent de conserver longtemps les tubes centrifugés mais ils nécessitent une centrifugation rapide et bien maîtrisé. Ces gels peuvent interférer avec certaines techniques de dosage. Par exemple en chimiluminescence (examen rare).

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. Autre substances additives : -Les inhibiteurs de la protéolyse : utiles pour les hormones peptidiques. -La déprotéinisation extemporanée du sang dans le tube de prélèvement par précipitation en milieu acide. -Les réducteurs, pour protéger certains composés (ex : glutathion pour dosage des catécholamines). -L’acidification ou l’alcalinisation du milieu (catécholamines ou dérivés méthoxylés urinaires)

> En fonction du dosage à réaliser un même tube peut/ne peut pas servir pour plusieurs dosages. Donc il faudra à partir de la prescription savoir combien de tubes vont être nécessaires. Parfois on a une multiplication des tubes de prélèvement : => ponction d’un volume important de sang (les tubes pouvant être différents/contenant différents composé) =>lourdeur du protocole de prélèvement.

! Schémas résumant le cycle d’un prélèvement en laboratoire (se lit de droite à gauche)

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� II. Le prélèvement

Le prélèvement doit être réalisé par une personne habilité, il faut vérifier l’identité du patient, respecter les règles d’hygiène (gant, blouse, désinfection des mains…), étiqueter l’échantillon, puis informatisation et réalisation automatique des analyses (la plupart), les résultats sont directement enregistré dans le dossier du patient.

1) Les tubes de prélèvement

Ils sont distingué par un code couleur au niveau des bouchons Normes internationales ISO 6710 pour le code couleur des bouchons

! *présence en plus d’un activateur de la coagulation pour faciliter la préparation du sérum.

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Par exemple les tubes à bouchons jaune contiennent un activateur de coag + séparateur de sérum, c’est un tube fréquemment utilisé pour de nombreux examens de biochimie.

! Elle passe sur ce schéma sans commentaire (ouf)

2) Les anticoagulants . Sels d’Héparines (héparinates de lithium, héparinate d’ammonium) Li : Iono Très utilisé pour l’obtention de plasma. Attention aux interférences (dosage du lithium, dosage de l’ammonium ou de l’urée)

. EDTA (acide éthylène diamine tétra-acétique) Hb glyq Inactive le calcium nécessaire à la coagulation, et autres ions tel que le magnésium (l’EDTA forme des complexes inactif avec les ions et métaux) Evidemment à ne pas utiliser pour doser le calcium, le magnésium et certains métaux lourd (Plomb)

. Citrate de Sodium : pour le dosage des facteurs de coag Inhibe également le calcium. Souvent utilisé pour des examens de la coagulation et vitesse de sédimentation.

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Ne pas utiliser pour les dosages de sodium.

. Inhibiteur de la consommation de glucose (fluorure de sodium, iodoacétate) : pour les suivis de glycémie Après prélèvement les cellules sanguines continuent la consommation de glucose en lactate, Les inhibiteurs sont utilisés avec un anticoagulant pour le dosage du glucose et du lactate.

III. Fiabilité de l’analyse

! Diapo s’intéressant à la validation des analyses.

Quand on fait des analyses en biochimie, ce sont généralement des analyses quantitatives avec des résultats exprimés en concentration (molarité ; g/L ; unités pour les enzymes) On établit des valeurs/intervalles de référence afin de comparer le dosage à un sujet normal, pouvant varier selon le sexe ou l’âge du patient et selon la méthode analytique choisie Plus le chevauchement est minime entre les valeurs d’un sujets sain et malades, plus la méthode est spécifique, moins on a de faux positifs/négatifs.

La méthode est validée après que l’on ait testé la spécificité, la sensibilité, la reproductibilité etc.

Il existe pour chaque paramètre que l’ont veut mesurer des contrôles de qualité : Échantillons calibré contenant le marqueur à doser dans des quantités bien précise. Ce contrôle permet des comparaisons entre laboratoire et tester la reproductibilité des résultats.

IV. Situations physiologiques - habitudes du patient :

Il faut savoir qu’il existe un certain nombre de facteurs biologique pouvant affecter les résultats :

. Jeûnes-régime Ex : Sujet normal après un repas standard de 700 calories=>augmentation physiologique : -des triglycérides jusqu’à 50% -des transaminases (20%) -de la bilirubine, des phosphates et du glucose (15%) -du potassium (10%) -de l’acide urique, des protéines totales, de l’albumine, du calcium, de l’urée, -du sodium et du cholestérol (3 à 5%)

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. Chylomicrons : Interférence directe sur le bilan lipidique et interférence avec la technique de dosage. Lipoprotéines qui se forment en période de digestion. Elles sont responsables du transport des lipides de l’intestin grêle vers les tissus adipeux périphériques. Si on veut faire un bilan lipidique on demandera un jeûne strict de 24h avant toute exploration du métabolisme lipidique mais aussi des glucides et lors de tout bilan hormonal.

. Stress : À ne pas négliger, notamment sur le bilan hormonal : cortisol, aldostérone, rénine, angiotensine, vasopressine, catécholamines, prolactine, insuline…

Intérêt de la mise en place d’un système de ponction par cathéter, avec un temps -5 ou -15 minutes dès la mise en place puis le début du test ou du bilan au temps 0.

. Rythme circadien : L’heure de la journée pendant laquelle on fait l’analyse peut avoir un impact important sur le bilan hormonal

. Position couchée-debout

. Grossesse-allaitement : modification du taux de certaines hormones mais également celle d’autres substances du métabolisme : électrolytes, protéines porteuses de certaines hormones, protéines de l’inflammation), lipides, enzymes. Il y a aussi une Augmentation du volume plasmatique à partir de la 10eme semaine et une augmentation de la filtration glomérulaire au cours du 3eme trimestre. Il y a aussi sécrétion de certaines protéines par le placenta (phosphatases alcalines, fraction placentaire)

. Le cycle menstruel (hormones)

. Exercice physique : Activité physique juste avant le prélèvement peut faire varier certains paramètres, une activité sportive au long cours entraîne des variations (les bilans des sportifs de haut niveau ont des fourchettes particulières)

. Tabagisme : modification de la concentration de carboxyhémoglobine et de lipoprotéines plasmatiques.

. Pathologie intercurrentes (Ictère=> bilirubine totale>250mg/L)

. Hypertriglycéridémie (à partir de 15g/L)

. Traitements intercurrents

. Facteurs liés à l’environnement de l’échantillon : -Exposition à la lumière (notamment un certain nombre de vitamines qui se dégrade à la lumière et qu’il faudra donc protéger lorsque l’on veut les doser) -Température -Pression

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. Cas particuliers : Les patients d’âge extrême : -Les nouveau-nés et enfant en bas âge : valeurs de référence différentes des adultes pour de nombreux paramètres. -Les Personnes âgées, pareil, on aura des valeurs de référence différentes.

. Le délai de transport On sait que le sang total est conservable dans les 6 à 8 heures à température ambiante (entre 15 et 22°C) > Le préleveur et/ou biologiste et/ou le TECH qui procède à un transfert d’échantillon vers un laboratoire doivent s’assurer que les conditions de transport sont satisfaisantes.

V. Autres paramètres importants lors de la phase pré-analytique . La centrifugation réalisée à température ambiante ou parfois à 4°C pour conserver les hormones par exemple

. Différence de centrifugation selon : Sérum ou plasma 1000-1300g 10-15mn Coagulation 2000g 15mn Urine 400 5mn

Si on veut obtenir du sérum et le conserver ultérieurement par congélation il faudra réaliser une centrifugation plus élevée : 4000g pendant 10mn ou 2000g pendant 20mn

VI. L’enregistrement des données

. Étiquetage correct des tubes -données lisibles -date/h de prélèvement -préleveur et prescripteur -Identité (entière ou abrégée), code barre -Age et sexe -Pathologie/Nom du protocole si le patient rentre dans un protocole clinique -Analyse(s) demandée(s)

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Protéines sériques / plasmatiques

I. Introduction : les fonctions du sang

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Dans le sang on va pouvoir détecter : − Pour les transports : nutriments, électrolytes, O2 et CO2, différents types de déchets, hormones.

- Pour les défenses : organismes étrangers, blessures/infection, coagulation, maintient de la température du corps, marqueurs (dans le plasma ou le sérum) d’agression par rapport à des infections (CRP).

Il y a donc des éléments constants et des éléments qui peuvent apparaitre uniquement dans certaines conditions pathologiques. Pour certains, on mesure une présence anormale, pour d’autres c’est une valeur anormale (sachant que ces éléments sont normalement présents mais peuvent passer vers une valeur anormale).

Maintien des valeurs normales : homéostasie.

! Ici c’est un petit rappel de ce que l’on trouve dans le sang circulant au niveau cellulaire : les plaquettes, les érythrocytes (globules rouges) et puis tout ce qu’on englobe sous le terme de « globules blancs » (granulocytes, monocytes et lymphocytes). Ils forment tous ce qu’on appelle les éléments figurés/cellulaires du sang.

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II. Distinction sang/plasma/sérum

1) Sang total

- Sang frais, juste prélevé, - Il correspond au plasma + cellules sanguines ou « éléments figurés du sang » (GR, GB ou

leucocytes, plaquettes).

! Lorsqu’on fait des analyses, il peut y avoir nécessité de prélever une partie du sang frais, car lorsqu’on a des prescriptions, on peut intégrer dans ces prescriptions d’analyse la numération formule sanguine, à faire sur le sang total. On va ensuite récupérer le plasma ou le sérum pour le reste des analyses.

Le sang frais est naturellement instable, il coagule après quelques minutes.

-Coagulum : plasma modifié, cellules sanguines et fibrine -Centrifugation : agrégat fibrine + cellules sanguines et plasma

2) Plasma vs sérum

Sérum = « artéfact »

- Sérum = surnageant du sang total après que le processus de coagulation se soit effectué. Il n’y a plus de facteur de coagulation. Contient des composés intracellulaires provenant des plaquettes et de leur activation, ce qui peut être un artéfact dans certains dosages.

! On obtient le sérum après coagulation puis centrifugation du sang total.

- Plasma = surnageant acellulaire obtenu par centrifugation du sang total, dont la coagulation a été inhibée par la présence de substances anticoagulantes.

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! On obtient le plasma après centrifugation du sang total auquel on a rajouté des anticoagulants.

Sur la plupart des échantillons, leur différence a peu d’importance. On utilise plutôt le sérum.

PROCESSUS PRE-ANALYTIQUE

! On peut être amené à vouloir récupérer spécifiquement les globules blancs. Il est donc possible de les séparer des globules rouges lors de la centrifugation. En présence d’anticoagulant, on va donc pouvoir séparer du moins dense au plus dense :

- Le plasma qui représente au moins 55% du sang total, - Une couche plus légère que les globules rouges qui correspond aux globules blancs et aux plaquettes,

et qu’on appelle le « buffy coat », qui représente moins de 1% du sang total - Les globules rouges qui correspondent à l’hématocrite et qui représente 45% du sang total.

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Sérum ou plasma ?

Selon les dosages, il est préférable de choisir le sérum ou le plasma : le sérum n’a pas la même composition que le plasma, puisque celui-ci a été modifié par la coagulation.

! Certains composés sont consommés durant la coagulation (exemples : glucose (peu influencé), fibrinogène). Leur concentration est donc abaissée dans le sérum par rapport au plasma.

! Certains composés sont produits ou libérés dans le sérum durant la coagulation (exemples : potassium, lactate, phosphates). Leur concentration est donc augmentée dans le sérum par rapport au plasma.

! Le plasma contient en plus un anticoagulant. Se référer aux bonnes valeurs de référence !

-Plasma : plus simple et plus rapide à obtenir. Théoriquement plus représentatif de la réalité physiologique d’un sang non coagulé. -Pour certains dosages : sérum selon la technique utilisée ou la présence d’anticoagulants dans le plasma qui peut générer des interférences.

3) Composition du sang et du plasma

Sang : (plus de) 45% d’éléments figurés (cellules) et 55% (plus de 50%) de plasma.

Plasma :

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Autres : - Nutriments (ex : Glucose et acides aminés)

a. Hormones (ex : Cortisol, thyroxine) - Déchets du métabolisme (ex : Urée)

- Gaz (ex : CO2, O2)

4) Fonctions des composés du plasma

1. Eau : ! Transport, vecteur de chaleur (car il y a un rôle dans le maintien de la température).

2. Electrolytes : ! Excitabilité membranaire, ! Osmolarité, ! Tampon (contre les variations de pH).

3. Nutriments, déchets, gaz, hormones : ! Pas de fonction dans le sang – transport simplement avec distribution aux différentes cellules et

organes appropriés.

4. Protéines… ! Très nombreuses mais avec des variations de quantités importantes. Certaines ont des fonctions dans le sang et d’autre sont simplement transportées. Parmi les protéines on peut citer l’albumine, les globulines, le fibrinogène.

III. Les dosages

Les dosages peuvent se séparer en dosages : • De routine, communs à de nombreuses pathologies :

-Ionogramme -NFS -βhcg

• Très spécialisés, liés uniquement à certaines disciplines cliniques : -Bilan hormonal -Toxico

1) Les dosages selon leurs indications : exemple de la β HCG

La βhcg est une hormone sécrétée par le placenta mais pas par le fœtus. On peut la détectée dés la 1ère semaine qui suit la conception et augmente pendant environ 8 à 10 semaines après le dernier cycle menstruel. Et environ 12 semaines après la conception, la concentration en hCG commence à diminuer quand le placenta commence à produire des hormones stéroïdiennes.

Son taux double toutes les 36 h et est détectable dans le sérum ou dans les urines. Et ça constitue aussi un test de grossesse ou quantitatif. Test de grossesse utilisé en gynéco, en pédiatrie ; et

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quantitatif en hormono (sérum).

2) Les dosages en biochimie

a) Le ionogramme plasmatique Avec a minima : Na, K, Cl, Urée, Créat, glycémie ! Il constitue le bilan de base majeur pour l’évaluation du statut métabolique du patient

b)Protéine totale et albumine ! Le suivi des protéines totales et de l’albumine (protéine majoritaire du sang) peut-être nécessaire pour évaluer l’état de nutrition et d’hydratation du patient. Ce sont pour la plupart des protéines de transport.

c) Les enzymes hépatiques ASAT (Aspartate Amino Transférase), ALAT (Alanine Amino Transférase) (= transaminases) et GGT (Gamma Glutamyl Transpeptidase).

! Ces 3 enzymes permettent la mesure de la fonction hépatique, de renseigner sur l’efficacité ou la toxicité de certains médicaments et sont les reflets de la cytolyse ou de la cholestase (stase de la bile dans les voies biliaires). Les organes les plus riches sont le foie pour les ALAT (Alanine Amino Transférase ou Glutamate Pyruvate transaminase) et les muscles ; y compris le cœur pour les ASAT (Aspartate Amino Transférase ou Glutamate Oxaloacétique Transaminase). L’ensemble de ces enzymes va être utilisé comme marqueur hépatique même si on voit que ce n’est pas forcément spécifique du foie. Toute altération de ces organes va libérer des transaminases.

d)La bilirubine totale :

La bilirubine est le principal produit de dégradation de l'hème. La source principale de bilirubine est la destruction des hématies au niveau hépatique, dont la durée de vie est de 90 à 150 jours. La bilirubine native (ou bilirubine non conjuguée) est très peu soluble dans l’eau. La conjugaison est donc une étape obligatoire pour que la bilirubine puisse être excrétée dans la bile.

e) Autres D’autres enzymes pouvant être recherchées : -Phosphatases Alcalines -Aldolase -5 α nucléotidase

! Sont les reflets d’anomalies au niveau hépatique mais aussi au niveau osseux par exemple. Ce qu’il faut savoir c’est qu’avec ces exemples de marqueurs qui ne sont pas forcément très spécifiques c’est qu’évidemment on ne les utilise pas seuls mais associés à d’autres marqueurs pour essayer de caractériser une pathologie ou un dysfonctionnement. Un dosage en biochimie est rarement un indicateur 100% sûr.

Il existe d’autres dosages classiques comme celui du cholestérol total. On peut aussi mesurer spécifiquement les HDL (High Density Lipoprotein = bon cholestérol) tandis que le LDL (Low Density Lipoprotein = mauvais cholestérol) va être calculé avec les taux de cholestérol total et de HDL total. On peut également doser les TG (triglycérides) pour les bilans lipidiques.

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f)Les marqueurs cardiaques :

On retrouve :

-Enzymes : CK (créatine kinase), CKmb (isoenzyme cellules du myocarde), -Troponine I, Myoglobine -BNP (peptide natriurétique de type B) - ASAT (aspartate amino-transférase)

-(LDH1)

Généralement on suit l’évolution de l’ensemble de ces marqueurs pour évaluer la fonction cardiaque.

! Sur le schéma ci-dessus, les marqueurs myoglobine, troponine et CK-MB permettent de suivre l’évolution de la fonction cardiaque et de caractériser notamment un infarctus du myocarde. Le diagnostic repose donc sur une cinétique d’évolution.

CK et CK-MB :

CK et CK-MB sont présentes dans les muscles squelettiques et dans le muscle cardiaque (ils ne sont donc pas spécifiques du muscle cardiaque).

Ces enzymes passent du cytosol vers le sang après lyse musculaire avec pour valeurs usuelles : 40–250UI/l.

Elles possèdent de nombreuses variations physiologiques :

• activité CK en fonction du sexe en lien avec la masse musculaire (H > F) • variation selon l’âge en relation avec activité physique : CK enfant > à CK adulte • exercice physique : > CK (+50%) • marathon : proportion CK-MB augmentée

CK et syndromes coronaires aigus : - Ischémie avec nécrose du myocarde : > CK

- Élévation 3 à 6h après les premières douleurs

- Pic entre 22 et 26h,

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• retour à la normale : 72h

- Dosage de la CK-MB encore utilisé pour le diagnostic de l’infarctus du myocarde ou suivi de la reperfusion en cas d’ischémie.

La troponine : à apprendre à mon avis ! seule partie du cours où elle met des ❤…c’est bizarre venant de Guiraud…

C’est le marqueur le plus cardiospécifique (100%) : il n’y a pas de faux positifs en cas de traumatismes des muscles squelettiques. ♥ Il permet le diagnostic précoce et rétrospectif d’une nécrose myocardique (il est spécifique cardiaque mais pas forcément spécifique de l’IDM) : - se positive 2 à 6 heures après le début des douleurs - reste élevée jusqu'à 9 jours après l’infarctus du myocarde (IDM)

♥ Les indications pour le dosage de la troponine sont : - le diagnostic de l’IDM, angor instable et micro-infarctus - infarctus péri-opératoires après chirurgie vasculaire ou non - suivi de reperfusion ♥ Le dosage est pratique et facile :

- 5 ml de plasma hépariné - résultats réalisés en urgence 24 h sur 24 - délai : 1 h après réception de l’échantillon

La myoglobine :

C’est une protéine de PM=17 800 localisée dans les cellules musculaires avec : – aucune spécificité cardiaque – élimination exclusivement urinaire – sujets sains : 6-80 ng/l

• intérêt : – c’est le marqueur le plus précoce (2 à 3h) – avec une demi vie courte = 1 à 3 heures • inconvénients : – absence de spécificité, – résultats augmentés également dans certaines maladies musculaires dégénératives et inflammatoires – « crush syndromes » : nécrose musculaire d'origine ischémique qui se complique d'une atteinte rénale plus ou moins sévère.

BNP=Brain natriuretic peptide / peptide Natriurétique de type B :

C’est peptide synthétisé essentiellement dans les ventricules suite à une augmentation de la pression et du volume diastolique. Sa concentration augmente dans l’insuffisance cardiaque. L’inconvénient est que sa demi-vie est très courte : 1⁄2 vie = 20 minutes. Par contre on a une corrélation des taux plasmatiques de BNP avec la sévérité de l’insuffisance cardiaque.

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g) L’électrophorèse des protéines :

Donc au niveau des protéines on peut les analyser séparément ou certains groupes de protéines particulières comme dans le cas de l’IDM. On peut aussi avoir besoin du taux de protéines totales qui se trouve dans le sérum. Il existe des méthodes de dosages spécifiques et puis des méthodes d’électrophorèse qui sont une évaluation des proportions relatives des protéines. Elle peut donner des résultats quantitatifs qui sont moins précis que certains dosages spécifiques mais cela donne quand même une idée de proportion relative qui peut être intéressante dans un certain nombre de pathologies comme dans les : – Dysprotéinémies – Gammapathies : variations anormales de taux de certaines immunoglobulines

h) La CRP (C reactive protein) : Le dosage de la CRP est très utilisé pour suivre l’évolution de l’inflammation chez un patient.

IV.Protéines plasmatiques

1. Fonctions, origine, variations des protéines

Fonctions des protéines (albumines, globulines, fibrinogène…) : − Maintien de la balance osmotique (albumines) − Tampon contre les variations de pH (albumines) − Transport de composés (ex : hormones insolubles dans l’eau, ions, médicaments) − Anticorps (ex : gamma globulines, immunoglobulines) − Facteurs de coagulation (ex : fibrinogène).

! Schéma reprenant les principales fonctions des principales protéines plasmatiques

Origine des protéines : La plupart des protéines ont pour origine le foie, sauf les gamma globulines qui sont produites par les lymphocytes B.

2. Principe de dosage

Dosage des protéines totales : − Méthode colorimétrique. − Exemple : méthode de Biuret (réactif qui se fixe aux protéines de manière non spécifique) − Valeurs normales plasma : 60 à 80 g/L.

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La méthode colorimétrique est plus facile et plus rapide à mettre en œuvre que d’autres techniques. Malgré une sensibilité peu importante, mais vue la fourchette, et vues les valeurs, on n’a pas besoin d’une sensibilité « extrême » au niveau de ce dosage, cette méthode est fréquemment employée.

Variations des protéines totales :

! !Hypoprotéinémie : dans les cas de malnutrition, d’atteinte du foie, de brûlures importantes !Hyperprotéinémie (par déshydratation) : anomalies du volume des liquides biologiques avec vomissements, diarrhées…

Principe

Ex : Réaction du biuret : mesure de la concentration en protéine d’une solution (par ex : plasma). Le biuret (réactif contenant du cuivre) réagit avec les liaisons peptidiques des protéines (!il n’est pas spécifique, mais très général) et forme un complexe violet détectable par technique spectrophotométrique.

! Il faut :

- Un échantillon blanc avec le réactif et de l’eau, - Un standard : échantillon calibré avec une solution d’albumine de concentration donnée qu’on fait

réagir avec le réactif en général pour arriver à un taux connu de protéines dans l’échantillon, - L’échantillon de concentration x

Ensuite, il s’agit du principe d’une courbe d’une gamme d’étalons, sachant que tout cela est maintenant automatisé. On mesure par rapport à des concentrations de référence, pour déterminer la quantité totale, ce qui se traduira par une variation de l’intensité de la couleur obtenue dans le milieu réactionnel.

Il existe des méthodes semi-automatisées, lorsque l’on a peu d’échantillons comme le colorimètre. Par contre le travail dans les laboratoires se fait sur des automates qui peuvent mesurer plusieurs paramètres en

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même temps.

On va obtenir des intensités de coloration différentes en fonction de la concentration en protéines. ! Mesure de l’absorbance à 550 nm en soustrayant le blanc (contrôle).

! T= échantillon S= Standard B=Blanc

Calcul de la concentration de l’échantillon

Concentration en protéines plasmatiques totales (g%) =

! Standard : témoin calibré en protéines.

3. Dosages

a. Albumine sérique/ sérum albumine

− Protéine majeure du sérum − Synthétisée par le foie − Maintien de l’osmolarité du sérum − Transport de petites molécules (transport de certains métaux, de molécules exogènes tels que les

médicaments, de molécules du métabolisme, de déchets).

En général lorsqu’on a une baisse du statut en protéines, c’est lié à une baisse de l’albumine. C’est donc un marqueur de dénutrition (statut déplété en protéines totales et albumine)

− Demi-vie : 14-20 j (pool important) − Mauvais indicateur précoce de déplétion/réplétion en protéines (parce qu’on a du mal à voir les

variations faibles et précoces) − Son taux peut être impacté par une affection hépatique (attention ce n’est pas qu’un marqueur de

dénutrition) − Son taux peut refléter un état de stress physiologique (diminution pendant la phase catabolique aigüe)

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Taux affecté aussi par : - Brûlures étendues - Syndrome néphrotique (perte dans les urines) - Certaines entéropathies (phénomènes de malabsorption qui entrainent une perte dans les

selles) - Pathologie cardiaque congestive et surcharge liquidienne (diminution par dilution) - Déshydratation (vomissements intenses et prolongés ou diarrhées ! augmentation par

concentration). Valeur normale : 40 - 45 g/l mais fourchette assez large.

b. Transferrine

− Protéine de transport du fer, − Demi-vie : 8-9 j (meilleur pour les variations de statut protéique)

!Elle peut être d’une indication plus « précieuse » à cause de sa demi-vie par exemple quand on essaye de supplémenter quelqu’un et d’améliorer son statut nutritionnel, car elle peut refléter le statut protéique général.

– Taux influencé par plusieurs facteurs :

o Augmenté en cas de déficit en fer (réponse de l’organisme pour optimiser la captation du fer) o Augmenté lors d’une grossesse, d’un traitement aux œstrogènes o Diminué dans certaines entéropathies, néphropathies, stress catabolique aigu, et altération

hépatique générale. − Intérêt reste malgré tout limité pour la mesure du statut protéique même si sa courte demi-vie peut

être intéressante. Elle est moins utilisée, car elle est en quantité moins importante donc il faut une méthode de dosage très sensible pour voir des variations.

c. Pré-albumine sérique

− Fonctions : - Protéine de transport pour la thyroxine (hormone thyroïdienne T4), - Forme des complexes avec la protéine de liaison du rétinol (vitamine A) (retinol binding

protein – RBP).

− Demi-vie courte : 2-3j, pool faible - Bon indicateur du statut protéique (sensible) - Répond plus rapidement que l’albumine ou la transferrine.

− Dosage préférable à l’albumine et à la transferrine dans les cas de suivi de nutrition, de déplétion, de réplétion en protéine. Il peut être associé à l’albumine si le suivi se fait. Cela permet un reflet de la réponse immédiate (demi vie courte) et sur le long terme grâce à l’albumine.

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d. Retinol Binding Protein

− Fonction : transport du rétinol (Vit. A) ! Forme des complexes équimolaires (1 :1) avec la préalbumine

− Turnover très rapide (12 h), pool très faible ! très difficile à utiliser car difficile à détecter ! Pas meilleur marqueur que la préalbumine

V. Protéines sériques

1. Méthodes d’étude

a. Dialyse b. Fractionnement sur colonnes c. Ultracentrifugation (centrifugation à très grande vitesse plutôt utilisée dans la recherche) d. Electrophorèse e. Immunoassay (certains peuvent être faits en faisant d’abord l’électrophorèse puis en faisant réagir l’Ac ! rechercher des protéines qui existent et les doser par cette méthode) : − Immunodiffusion radiale (réaction Ag-Ac par diffusion dans un gel), − immunophélométrie (réaction de précipitation après apport d’un Ac dirigé contre la protéine), − immunofluorometrie (Ac avec marqueur fluorescent), − radioimmunoassay (Ac avec marquage radioactif).

f. Immunoélectrophorèse : consiste à faire réagir les Ac avec le milieu réactionnel avant l’électrophorèse. (! pour une protéine qui n’existe pas normalement dans le milieu)

2. Electrophorèse

Electrophorèse des protéines sériques Protéinogramme = analyse des protéines sériques Avec dosage des protéines totales

Quand on fait une électrophorèse sur un échantillon de sérum, on fait ce que l’on appelle un protéinogramme et on va alors analyser ce qui est présent dans l’échantillon. D’abord on a une électrophorèse qui donne le résultat que l’on voit sur le dessus du graphique. Rappelons que l’électrophorèse se fait par migration électrique en déposant du sérum sur un gel. On va alors obtenir des bandes avec ensuite une coloration (ex : bleu de Coomassie).

! On voit des intensités, donc des quantités de protéines différentes. La bande très sombre correspond à l’albumine, protéine majoritaire dans le sérum. Généralement, cette analyse doit être couplée avec le taux de protéines totales de l’échantillon. Donc on dose les protéines totales et par la suite on va séparer par électrophorèse les différents groupes de protéines.

Sur ces gels on va pouvoir passer à une notion quantitative et donc au graphe en dessous en utilisant un

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densitomètre, un appareil qui va balayer le gel et convertir l’intensité des bandes en graphe et donner un graphique qui représente la position des bandes sur le gel et donner la proportion relative des différents types de protéines présents dans l’échantillon.

Classiquement on distingue différents groupes : - Le pic albumine - Le pic alpha 1 - Le pic alpha 2 - Le pic béta 1 - Le pic béta 2 - Le pic gamma

On utilise un gel d’acrylamide sur lequel on dépose du sérum et on va le faire migrer dans un champ électrique classique de l’électrophorèse. Ensuite on procède à la coloration.

L’expression des résultats se fait en mesurant la teneur en protéines totales et l’analyse densitométrique qui donne les pourcentages de chaque fraction. Grâce à des calculs, on peut remonter à la concentration (g/L) de chaque fraction.

On calcule généralement le rapport : albumine/globuline. On peut l’utiliser en cas de diminution ou d’augmentation du taux de protéines totales, pour savoir quelles fractions sont concernées, à quoi cela est dû. Ou savoir si c’est par exemple une diminution générale qui peut plus indiquer un phénomène très général tel

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que la néphropathie ou autres, ou si c’est quelque chose de plus spécifique, qui varie plus particulièrement.

! Les causes d’erreurs :

- Sérum hémolysé : où l’on ne va pas avoir éliminé correctement les éléments figurés du sang. Des cellules se sont alors lysées et ont libéré leur contenu, et cela peut fausser l’analyse.

! - Présence de fibrinogène : si l’on n’a pas éliminé correctement le fibrinogène par coagulation, il peut

être présent en quantité suffisante pour fausser le graphique que l’on obtient.

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Dans les différents groupes on retrouve :

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- L’albumine, - L’alpha 1 dans lequel on va retrouver des composés qui sot essentiellement l’orosomucoïde et l’α1-

antitrypsine, - L’alpha 2 : céruloplasmine (protéine de transport du cuivre), α2 macroglobuline, l’haptoglobine, et

les α-lipoprotéines, - Le β1 : transferrine, - Le β2 : C3 (complément) et β-lipoprotéines, - Le γ avec les immunoglobulines (IgA, IgG , IgM ) et la CRP (marqueur de l’inflammation )

Dans chaque groupe, on n’a pas qu’une seule protéine. En effet ,si on constate des variations , juste en regardant le protéinogramme ,on ne pourra pas dire de quelle protéine il s’agit. Elles sont classées par « caractéristiques » proches.

À noter : l’ensemble des protéines totales peut être normal, mais dans certaines pathologies ce sont les proportions relatives qui vont changer, d’où l’intérêt de cette analyse.

" Voici quelques exemples de ce qui peut entrainer des modifications

! La fraction α dans les réactions inflammatoires peut connaitre des variations. Par exemple , pour α1 , on peut avoir une réaction de phase aigue de l’inflammation , un cas d’emphysème, et autres possibilités. Pour l’α2, il va y avoir des réactions de la phase aiguë de l’inflammation : c’est un reflet de certains phénomènes d’hémolyse (groupe faussé par l’hémolyse artificielle du sérum, et en cas de phénomène hémolytique chez une personne, il y aura aussi une modification de ce groupe de protéines). ! Pour la fraction β, cela peut refléter une variation des protéines de transport du cuivre et du fer.

! Pour la partie γ cela peut refléter des déficits immunitaires ou les gammapathies monoclonales. Cela fonctionne en association avec d’autres résultats

La encore ces résultats sont exploitables s’ils sont en association avec d’autres résultats.

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3.Principales situations pathologiques

Principales situations pathologiques dans lesquelles on va être amené à compléter les analyses par ce type d’examen (protéinogramme) :

- Inflammation, - Insuffisance hépatique, - Syndrome néphrotique, - Déficit immunitaire, - Immunoglobuline monoclonale.

a. Inflammation

! Syndrome inflammatoire protéique

On a ici des modifications que l’on constate en fonction du nombre de jours selon les différentes protéines impliquées, donc qui varient lors de l’inflammation aiguë. La CRP en bleu, et d’autres protéines que l’on peut mesurer sont sujettes à des variations plus ou moins intenses. C’est la CRP qui répond le plus rapidement. On note qu’il n’y a pas de variations particulières pour l’albumine.

! Sur le graphe on a :

- En noir la courbe normale, - En bleu l’échantillon correspondant à un patient en situation d’inflammation aiguë, - Sur les bandes « N » est le témoin normal.

Pour ce qui est des différentes catégories de protéines, la réaction inflammatoire aiguë va provoquer :

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- Pour l’albumine, soit pas de variation soit une diminution, - Pour la fraction α1 une augmentation qui est d’ailleurs retranscrite sur la courbe, - Pour la fraction α2, augmentation également, - Pour la fraction β, légère diminution, - Augmentation de la fraction γ à cause de la CRP (marqueur de l’inflammation).

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Ces résultats doivent être couplés à d’autres analyses, on ne se contente pas du protéinogramme. On va aussi doser la CRP pour corréler l’ensemble et réaliser d’autres types de dosage.

b. Insuffisance hépatique Sur le graphe on a en noir le témoin et en bleu ce qui est mesuré chez le patient.

On note une diminution très importante de l’albumine, diminution très importante de la transferrine, diminution de l’haptoglobine. A noter : Si il y a un phénomène de lyse cellulaire , on aura une augmentation de certaines autres protéines par « relargage » .

Ici encore nous ne pouvons pas affirmer une insuffisance hépatique qu’avec ces résultats , nous devons réaliser d’autres examens tel un dosage des enzymes hépatiques…

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c. Syndrome néphrotique

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Dans le syndrome néphrotique, on a des anomalies (fuite glomérulaire), qui vont entraîner une protéinurie anormale donc une fuite protéique. On va corréler le protéinogramme à une analyse des urines dans ce cas-là.

!

On a : - Une diminution importante de l’albumine, - Diminution de la partie α1, - Augmentation importante du pic α2 (car réaction inflammatoire en parallèle ) - Diminution globale de β (perte de transferrine ) et γ ( perte des IgG ).

Ceci s’explique car on a la réaction de fuite protéique et en parallèle une réaction inflammatoire (donc marqueurs inflammatoires augmentent). Donc, il n’y a pas de diminution drastique, générale, de l’ensemble.

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d.Déficit immunitaire

! Il n’y a qu’un seul groupe de protéines qui est modifié sur le protéinogramme, c’est la fraction γ. Donc diminution importante de la partie des gamma globulines qui se retrouve au niveau plasmatique ou sérique. Cela est facile à mettre en évidence comme nous pouvons le voir sur ce diagramme.

e. Immunoglobuline polyclonale VS monoclonale

!

On peut avoir une augmentation globale et polyclonale des immunoglobulines. On aura une augmentation uniquement au niveau de la fraction gamma , le reste n’est pas modifié. ! Ici, polyclonal signifie que c’est l’ensemble des groupes qui va être compté. Donc, dans ce cas, on voit une augmentation générale du pic. Dans le groupe, plusieurs types sont assez proches : cela donne un pic assez étalé, et on a donc un même aspect mais une augmentation en quantité par rapport au témoin.

Hypergammaglobulinémie polyclonale en cas d’infection : région gamma globuline augmentée, avec un pic étalé : tout le système immunitaire est mis en jeu donc toutes les Ig.

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L’Hypergammaglobunémie monoclonale : Ici, UN seul groupe d’IgG va être augmenté spécifiquement. L’aspect est donc caractéristique, ce n’est plus étalé mais on a un pic très net. En effet une seule des protéines est augmentée par rapport aux autres. C’est quasiment le seul cas qui nous permet de faire un diagnostic.

! Ne pas retenir le tableau ci-dessus dans le détail juste savoir que quand c’est monoclonal , c’est sur un isotype particulier des Ig.

V. Conclusion

Intérêt du protéinogramme : − Toujours interpréter en fonction du taux de protéines totales. − Le seul intérêt diagnostique = dépistage d’une gammapathie monoclonale. − Au plan évolutif et pronostique = surveillance des patients

! Inflammation, ! Atteinte hépatique ou rénale, ! Immunologie (en dehors de la gammapathie monoclonale)

Exemple des modifications du protéinogramme dans quelques pathologies. La prof est passée rapidement dessus. Non exhaustif.

ANNALES seront mis en annexe quand les roneistes me l’enverront

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