Isolation and characterization of the glucocerebrosidase from human placental tissue

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    12-Apr-2017

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Prsentation PowerPoint

Biochimie-Gntique Humaine: Analyse darticles Ralis par:Encadr par: TILIRINE Khalid BEN ALLA SafaM. Mohamed BAAZIZ.BOUTASKNIT Abderrahim

Isolation et caractrisation de la glucocrbrosidase partir du tissu placentaire humain

UCAM-FSSMMaster Biologie Environnement et SantDpartement du Biochimie 2014/2015

IntroductionI/ Matriel et MthodesII/ Rsultats III/DiscussionConclusion & perspectives

Plan du travail

La -glucocrbrosidase encore appele glucosylcramidase, Acide -glucosidase , et D-glucosyl-N-acylsphingosine glucohydrolase, est une hydrolase qui catalyse le clivage de la liaison entre l'unit cramide et le rsidus de glucose d'un glucocrbroside. Elle se trouve dans les lysosomes responsable de la dgradation dun lipide, le glucocrbroside (ou glucosylcramide).La masse = 59,7 kDa.Les mutations de cette enzyme provoquent une maladie lysosomale caractrise par l'accumulation de glucocrbrosides dans les lysosomes maladie de Gaucher

La Glucocrbrosidase?

La Maladie de Gaucher

Un dficit en GCase (diminution de la qualit et/ou de la quantit de la protine)accumulation de glucocrbroside normalement limins ou recycls par lorganisme (surcharge lysosomale).

La maladie classe en trois types ayant des diffrences en terme dge dapparition et de gravit : {I (95 sur100 cas) II et III}Symptomatologie:Une sensation de fatigueune augmentation de volume du ventre,des douleurs des os et des saignements du nezdes gencives ainsi que des bleus (hmatomes) qui apparaissent en labsence de traumatisme.

Objectifs de ltude l'isolement de la glucocrbrosidase partir de tissu placentaire des patients atteints par la maladie de Gaucher. la purification de la glucocrbrosidase partir de cette source humaine Indiquer certaines proprits catalytiques et physiques de la GC ase purifie.

D[1-14C]Glucocrebroside synthtis.Glucosyl [1-14C] sphingosine prpar partir de la glucocrbrosidase marque.Taurochlorate de sodium et dithiothreitol Sphadex G-200 et et sphadex-CM (pharmacia fine chemicals Inc)La Cellexe-P (consiste une cellulose phosphate).Tissus placentaires atteints de Gaucher (1.7 kg).Solutions et tampons organiques (ethanol, mthanol, 4,dinitro-benzne 1%, ).

Les procdures exprimentales:# Matriel:

# TechniquesLa chromatographie sur couche mince:

* Utilisation de 1-Butanol-acide actique et de leauun seul point avec 0,6RF* Le compos a t dissout 162.* Les placentas humains frais ont t immdiatement places dans la glace, dlivres et conserves 0 jusqu ce quils seront traits.

Lanalyse de lactivit enzymatique:

- Lactivit de GCase a t dtermine par incubation de lenzyme dans 0.2 ml de solution de tampon phosphate de potassium 75 mM. PH 6,4 avec 0,12% de Cutscum (dtergent non ionique utilis pour solubiliser) + taurocholate de sodium+glucocrbroside. - Aprs incubation 37 pendant 1h, la racation a t freine par lajout d1ml de la solution du srum humain de lalbumine dans leau (10 mg/ml w/v) et 0.1 ml de la solution de lacide actique et du taurocholate.- Le [1-14C] Glucose cliv par l'enzyme tait rcupr et sa radioactivit a t dtermine.- La protine a t dtermine par la mthode de Lowry et al.

La purification de la GCPour lextraction, Les Placentas frais rfrigrs ont t librs du sang fix par rinage avec de leau distille froide.Le tissu placentaire doux est pass travers un hachoir viandeBroyage, et mise en suspension dans 2 volumes (W / v) d'eau distille.Agitation pendant 1 heure 4Centrifugation 10 000 x g pendant 20 min.Dcantation et mise en suspension de la matire sdimente.homognisation dans un mlangeur Waring pendant 1 min 4 La matire homognise a t centrifuge 10 000 x g pendant 25 min

Fractionnement solide du sulfate dammonium247 g/l de sulfate dammonium + l'extrait d'enzyme sous agitation. Centrifugation 10 000 x g pendant 30 min. limination du matriel sdiment +ajout du 70,25g/l de sulfate d'ammonium.

Aprs 1h dagitation et centrifugation apparition dun film sur la surface du liquide (Il contient la majeure partie de l'activit de la GC ase).

cumassions et mise en suspension dans le tampon citrate-phosphate (pH6).

Dialyse pendant 24h

Centrifugation 40 000 X g pendant 30 min

La filtration sur gel- chromatographie changeuse dions250 ml de la solution poss sur une colonne (9 x 55 cm) de Sephadex G-200 quilibre par Citrate-P.Llution de la GCase partir de la colonne avec 2 litres d'un gradient linaire de NaCl allant de 0 500 mM les fractions ont t rassembles et appliques une colonne (4 x 50 cm) de CM-sephadex A-25.Quand la [NaCl]=250 mM Apparition de lenzyme Les fractions enzymatiques sont dialyses pH 5.Lchantillon est plac sur une colonne (2,5 x 50 cm) de Cellex-P. lution avec 1L de NaCl (0 500mM).Dialyse et Chromatographie nouveau deux fois sur des colonnes (2 x 20 cm) de CM-Sephadex .Dans toutes les tapes de chromatographie l'enzyme a t lu comme un seul pic symtrique partir de laquelle la majorit de l'enzyme dans des fractions les plus actives ont t rassembles pour les tapes ultrieures

Rsultats

Table I: Effet du dtergent sur l'extraction des glucocrbrosidase de placenta humainLe taurocholate de sodium a t ncessaire pour l'extraction efficace de lenzyme.

Cutscum ntait pas ncessaire pour l'extraction mais ncessaire dans les tapes de fractionnement

RsultatsFIG. 1. Gel de filtration a t ralise sur des colonnes (1,6 X 84 cm) de Sephadex G-200 Le profil d'lution est htrogneLe profil d'lution est homogne

Rsultats

Tableau II: La purification de la glucocrbrosidase partir de placenta humainLa rcupration de la glucocrbrosidase purifie la prsente procdure d'ensemble en moyenne d'environ 5% de l'activit de dpart.

RsultatsFIG. 2: profils protiques obtenus par lectrophorse sur gel de dodcyl sulfate de sodium.

Rsultats

FIG. 3: Estimation de la masse molculaire de la glucocrbrosidase par lectrophorse sur gel de dodcyl sulfate de sodium

Rsultats

Tableau III: Activit de divers enzymes hydrolytiques dans l'extrait placentaire non fractionne et en prparation de la glucocrbrosidase hautement purifie

Rsultats

Tableau IV: Rapport entre l'activit de la glucocrbrosidase et lactivit 4-mthylumbellifryl--D-glucosidase diffrents stades de purificationLe rapport de l'activit catalytique au lipide naturel augment travers les tapes de purification

Rsultats

Tableau V: L'hydrolyse de divers substrats par glucocrbrosidase purifie de placenta

Fig. 6: Inhibition de l'hydrolyse du (1-14C) glucocrbrosidepar p-aminophnyl--D-glucopyranoside.Rsultats

Discussion Les critres de lhomognit indiquent que la prparation ainsi obtenu dans cette recherche est hautement purifier.Le produit final est enrichi 4100 fois plus quun extrait de placenta non fractionneLextrait brute de placenta est non contamin par 14 enzymes lysosomale.Une seule bande de GCase apparait sur gel de dodycil sulfat.

Les dtergents sont ncessaire pour lextraction enzymatique et la rsolution chromatographique. le glycrol et le dithiothritol maintenu la stabilit de lenzyme.La taille molculaire de l'enzyme varie considrablement en fonction de la mthode d'extraction et de l'tat de puret.

Discussion

Le rendement de lenzyme purifier par les techniques ainsi utilise tait faible (5%).Pour un isolement denzyme plus efficace, une nouvelle technique tait mis en vidence.les perspectives d'tudes de remplacement d'enzyme ncessitera des mthodes plus pratiques et efficaces d'isolement.tant donn que la Chromatographie d'affinit a t applique avec succs pour l'isolement de -galactosidase.

Discussion

Des tudes sont actuellement en cours dans l'esprons dobtenir lenzyme pure sous une forme et en quantits appropries pour valuer l'efficacit de la thrapie de remplacement de la maladie de Gaucher.La thrapie de remplacement enzymatique permettra dvit un bon nombre des risques et des complications rencontres actuellement dans la transplantation d'organes.Discussion

Traitement substitutifPar La bta-glucocrbrosidaseLenzyme de synthse ayant obtenu lautorisation de mise sur march est limiglucrase (CrzymeR). Produit par culture de cellule de mammifres CHO.Sous le traitement substitutif une amlioration clinique apparait aprs 3 6 mois.Le traitement substitutif reste actuellement le traitement de rfrence et doit tre propos en premier intention.

Discussion

Traitement par rduction de substrat

Miglustat, administr par voie orale, est utilis en deuxime intention dans la MG de type 1 en cas dimpossibilit dutiliser le traitement enzymatique substitutif.

Discussion

Le disfonctionnement de certaine enzymes mnent des maladies mtabolique plus ou mois grave, que ce soit les maladies gntique du mtabolisme des glucides ou celle touchant le mtabolisme des lipides ou les maladies touchant les mitochondries.La purification et la caractrisation des enzymes mise en jeux par des techniques plus sophistiques permet de connaitre leurs structures et les proprits catalytiques.

Thrapie enzymatique

Conclusion

MERCI Pour votre attention!

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