Métabolomique : Concept et perspectives

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Dimitri Heintz

Activité

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• Plateforme Métabolomique • Petites molécules bioactives

• Chromatographie • Spectrométrie de masse

Plan

• Définitions

• Les outils de la métabolomique

• L’identification des métabolites et Le problème des banques de données

• Applications

• L’imagerie métabolique par spectrométrie de masse

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Définitions

• Métabolome: ensemble des constituants de faible masse moléculaires d’une cellule ou d’un organisme.

• Métabolomique: analyse de l’ensemble des constituants de faible masse moléculaires d’une cellule ou d’un organisme.

• Fluxomique: analyse de l’ensemble des flux métaboliques au sein d’une cellule ou d’un organisme

Apparu à la fin des années 1990

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Définition de la métabolomique

• La métabolomique: l’analyse de l’ensemble des molécules de petite masse moléculaire (une limite arbitraire est fixée à 1000 ou 3 000 uma) d’un système biologique.

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Les différentes approches métabolomiques

On peut distinguer deux grands niveaux d’analyses complémentaires :

• Les analyses dites ciblées

• Les analyses dites globales

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Le profilage métabolique

Il s’agit ici d’analyser tous les composés appartenant à une voie métabolique

ou à une famille chimique donnée.

Ce type d’approche a pour but une meilleure compréhension de la fonction ou de la régulation d’une voie métabolique et/ou de ses liens avec les autres voies métaboliques.

Elle cherche ainsi à comparer des profils ou des empreintes de métabolites qui sont modifiés en réponse à une pathologie ou à une exposition à un toxique, mais l’identification et la quantification absolue des métabolites modifiés ne sont pas recherchées

cherche à donner une signification biologique aux variations observées.

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L’analyse ciblée

Elle a pour objet de mesurer quantitativement et spécifiquement un ou un nombre réduit de Métabolite

Les analyses effectuées dans ce cadre sont quantitatives, précises et sensibles et s’apparentent à des dosages en milieu biologique classique.

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Les étapes majeures

Préparation des échantillons

• Extraction protocol

• Derivatizations

l’analyse des échantillons

• Suitable analytical methods, LOD

• Reproducible analytical protocol,

• Data collections and storage

Analyse des données

• Data deconvolution software

• Software development

• Bioinformatique

• Identification of up/down regulated compounds

• Major bottleneck

• Databases, for new compounds “de novo”

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The cycle of the metabolomics workflow.

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Métabolites et métabolome

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Métabolomique en clinique

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Métabolomique clinique

• > 95 % des essais cliniques, diagnostic, sont des petites molécules

• 89% des médicaments sont des petites molécules

• 50% des médicaments sont des dérivés de métabolites

• 30% des maladies sont des maladies du métabolisme

• Métabolites sont des entités fonctionnelles, des cofacteurs et jouent des rôles dans la signalisation de > 1000 protéines chez l’homme

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Les outils de la métabolomique

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Acquisition des empreintes métaboliques

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Déroulement d’une analyse métabolomique

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Le problème en métabolomique c’est l’absence de banques données de petites moléculues

Gène ID, abondance des transcrits

Protéine ID, concentration

Métabolite ID, concentration

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Principales bases de données métabolomique

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The human Metabolome project

• http://www.hmdb.ca/

• Genome Canada Project lancé en janvier 2005 7.5 Millions de $

• Objectifs: recenser et quantifier les différents métabolites des tissus et biofuides

• (urine, plasma, LCR)

• Déterminer Les empreintes métaboliques pour: chaque patient/maladie/sexe/age/

• Développement d’outils et de technologies et de protocoles for l’analyse quantitative en métabolomique

• Création d’une banque de métabolites

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20 03/09/2013

7000

21 03/09/2013

Human metabolome

41519 métabolites en septembre 2013

1600

3100

28000

7000

1800

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Plusieurs variables & plusieurs métabolites

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Pourquoi une base de données

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En spectrométrie de masse l’ionisation est variable d’un instrument à un autre donc pas possible d’avoir une seule banque unique Exception: la GC-MS mais pas très sensible /à la LC-MS/MS

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Plan

• Définition: imagerie in situ par spectrométrie de masse

• Principe

• Préparation de l’échantillon, la coupe histologique (étape clés)

• Applications:

– Surface de tissus animaux / humain

– Surface de tissus végétaux

– Autres surfaces (biologique ou non, boues, plastique…)

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Histologie de l'appareil respiratoire: portion de poumon

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Les Métabolomes

Bronches (BR), artère pulmonaire (A), bronciole (br)

Chaque type cellulaire a son Métabolome

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Métabolome A Métabolome B

Métabolomes C

Métabolome D, E…

Plusieurs Métabolomes sont mélangés

Histologie de l'appareil respiratoire

Metabolomique « classique » Extraction/ broyage/biopsie…

Difficile de trouver un marquer spécifique dans ces conditions

La Problématique de la Métabolomique sur les tissus

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L’imagerie in situ par spectrométrie de masse

• Technologie émergente

• possibilité d’identifier des molécules sur des échantillons solides

• Permet d’analyser directement des molécules à la surface des tissus sans marquage

• Les molécules:

• Permet de déterminer la distribution spatiale et temporelle de molécules dans des tissus

• Résolution spatiale max (5µm )

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Métabolites Médicaments Protéines Peptides Lipides tRNA RNAs

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Imagerie in situ par spectrométrie de masse

0

20

40

60

80

100

120

2000

Nombre de publications /an

2000 2005 2010 2012

humain

Plantes

Souris/rat

Stoeckli, M., Chaurand, P., Hallahan, D. E., and Caprioli, R. M. (2001) Imaging mass spectrometry: a new technology for the analysis of protein expression in mammalian tissues. Nat. Med. 7, 493–496 Chaurand, P., Schwartz, S. A., and Caprioli, R. M. (2002) Imaging mass spectrometry: a new tool to investigate the spatial organization of peptides and proteins in mammalian tissue sections. Curr. Opin. Chem. Biol.6, 676–681 Fournier, I., Day, R., and Salzet, M. (2003) Direct analysis of neuropeptides by in situ MALDI-TOF mass spectrometry in the rat brain. Neuro Endocrinol.Lett. 24, 9–14

Article pionnier: Caprioli RM et al Anal. Chem (1997) Ancêtre: Hillenkamp F el al Appl. Phys. A: Mater. Sci. Process (1975)

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imagerie in situ par spectrométrie de masse

• Identification-spatiotemporelle de molécules dans des tissus biologiques

• Identification de plusieurs molécules dans une même analyse

• Identification de molécules dans un organisme entier ou dans un organe

• Couplage possible avec la microscopie classique

• Compatible avec les techniques histologiques (oui en Protéomique)

• Compatible avec les méthodes Protéomiques & Métabolomiques

• Obtention d’images moléculaires > 100 Mbytes / Gbytes/échantillon

Image moléculaire

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Il existe différentes méthodologies d’imagerie in situ par spectrométrie de masse

• MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization)

– SIMS (secondary ion mass spectrometry)

– DESI (Desorption electrospray Ionization)

– Mobilité ionique (à suivre)

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1 2

3

MALDI: technique d’ionisation très sensible

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Sensibilité de l’imagerie par spectrométrie de masse

MALDI Imaging IM-FTICR

IM-MS/MS ?

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Préparation de l’échantillon(étape clés)

preparation

Cryosections (8-12µm)

MALDI matrix preparation (SA, DHB or HCCA)

Congélation / inclusion…

Cryo-microtome

Matrix coated section (8-12µm)

Air brush pistol

Les molécules s’ionisent

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1

2 3

4

• la coupe histologique • Le dépôt de la matrice

L’ionisation en MALDI Imaging

• Il y aura transformation des molécules en ions • on va mesurer la masse exacte des ions pour identifier finement les molécules • Le choix de la matrice est un point clés

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Préparation de l’échantillon(étape clés)

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Comment obtenir une image moléculaire par MALDI imaging?

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Image moléculaire

Comment obtenir une image moléculaire

2500 5000 7500 10000 12500 15000 17500 20000

• Préparation d‘une coupe d‘un tissus recouvert de matrice déposée sur une plaque MALDI

• On tire sur la coupe avec un lazer UV (source MALDI) • On obtient des spectres MALDI MS ou MS/MS • Conversion des spectres en pixels

200 µm pixels

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4963 Da 4938 Da 5433 Da optical image

6230 Da 6551 Da 6713 Da 5764 Da

7843 Da 14092 Da 18358 Da 7542 Da

On peut identifier différentes molécules dans différentes régions du cerveau

Image resolution 80µm

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optical image 18385 Da 6230 Da 7843 Da

4938 Da 6651 Da 6713 Da

4963 Da 5764 Da 10607 Da

On peut analyser simultanément plusieurs molécules ou alors faire une recherche à l’aveugle (profiling)

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m/z = 313.1485

Etude de la distribution spatiale et temporelle d’un médicament dans le rein d’un rat à 30 min et à 2h

T = 30 min T= 2h

Imagerie MALDI: Etudes pharmacocinétiques

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45

m/z = 5470 Da m/z = 6177 Da m/z = 18746 Da

1mm

Plusieurs molécules sont co-localisées dans une zone particulière: distribution région – spécifique des molécules

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Importance de la resolution en métabolomique

Il faut pouvoir identifier un métabolite avec la plus grande précision (0.0112 Da différence)

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Projet collaboratif autour du développement du MALDI imaging

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Préparation de l’échantillon

• Besoin de l’expertise en histologie

• Faire une coupe d’un tissu n’est pas toujours facile

• Microtome/cryomicrotome, fixations, inclusions….

• Les constructeurs et les plateformes n’ont souvent pas cette expertise

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Les matrices

• En métabolomique le problème est que la matrice est un métabolite

• En métabolomique il n’y a pas de matrice universelle

• Choix de la matrice est fonction de la molécule à analyser

• Développement majeure des prochaines années – Lavage des tissus (enlever les sels)

– délipidation (baisser la suppression d’ions)

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Etude pharmacocinétique par MALDI Imaging

Distribution spatio-temporelle d’un médicament chez la souris

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Famotidine médicament utilisé dans le traitement des ulcères (estomac ou du duodénum). Il réduit la production d’acide et de pepsine ainsi que le volume de la sécrétion gastrique

Administration de Famotidine à une souris

3 minutes La sourie est sacrifiée

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Etude pharmacocinétique par MALDI Imaging

Distribution spatio-temporelle par MALDI Imaging de la Famotidine

Questions: - ou se trouve la Famotidine , dans quel(s) tissus au bout de 3 minutes ? - à quelle concentration ? - quels sont les produits du catabolisme de la Famotidine (conjugués…) ?

Distribution spatio-temporelle par MALDI Imaging de la Famotidine chez la souris

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Accumulation de la Famotidine dans les reins

La coupe est recouverte de matrice DHB

Les molécules s’ionisent

Résolution spatiale basse: 200µm

Famotidine MW= 337.449 g/mol

[ M+H+]

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Accumulation de produits du catabolisme de la Famotidine dans les reins

Distribution spatio-temporelle par MALDI Imaging de la Famotidine chez la souris

[ M+H+]

+/- Na

+/- OH Famotidine

338.05> 259.06

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Identification de bio-marqueurs du cancer du foie

Modèle: souris/ xénogreffe de cellules / cancer colorectal humain

Injection par la veine porte de cellules HCT116 (GFP-tagged human colon cancer cells)

Propagation du cancer dans le foie

Souris âgée de 13 semaines

2 semaines

Animal est sacrifié 2 semaines après injection

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Identification de bio-marqueurs du cancer du foie

Identification des zones cancéreuses par microscopie à fluorescence ou par microscope optique

Identification de bio-marqueurs du cancer du foie par MALDI Imaging

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Dosage du gluthation dans le foie (GSH)

10µm

Échantillon: foie de souris Résolution spatiale: 10µm Matrice: 9-AA(aminoacridine)

Dosage du glutation dans le foie (GSH) par MALDI Imaging

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P: parenchyme M:Metastase

Augmentation de GSH dans les tissus cancéreux

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Conclusion

La métabolomique par spectrométrie de masse et imagerie in situ • Technologie émergente • possibilité d’identifier des molécules directement sur des échantillons solides • Sans marquage • Résolution tissulaire (5µm) • MALDI Imaging est la technique la plus avancée • Sensibilité par encore très élevée

Combinaison de différentes expertises

• spectrométrie de masse • Métabolomique • Imagerie & microscopie • Histologie • Bioinformatique

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Conclusion sur l’imagerie in situ par spectrométrie de masse

• l’acquisition des données & le traitement des données facteur limitant reste le temps d’analyse lui-même est tributaire de: - la fréquence de répétition des tirs - la rapidité de déplacement de la cible - temps d’acquisition de l’éléctronique

Ex: à 1Hz l’acquisition durera une journée à 100Hz l’acquisition durera quelques heures

+ la durée d’analyse est importante: + l’échantillon sera dégradé + il y aura évaporation de la matrice sous vide • La seule technique qui permet d’identifier finement plusieurs molécules

sans marquage sur des tissus

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Merci

dimitri.heintz@ibmp-cnrs.unistra.fr