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Outils moléculaires disponibles pour surveiller la résistance aux antipaludiques - Présentation de la 5e édition du Cours international « Atelier Paludisme » - Claude GIRY - Biologiste - Centre Hospitalier - Mamoudzou, Mayotte - [email protected]
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Atelier Paludisme 2007
Outils molOutils molééculaires disponibles culaires disponibles
pour surveiller la rpour surveiller la réésistance aux sistance aux
antipaludiquesantipaludiques
Claude GIRY
Centre Hospitalier de Mayotte
EVALUATION
par les FACILITATEURS
Atelier Paludisme 2007
Problématique
� La résistance aux antimalariques repose sur 3 mécanismes :
� Mutations ponctuelles
� Amplification génique
� Activité transcriptionnelle
� A chaque mécanisme correspond un ou plusieurs gènes dont l’altération est associée à une résistance médicamenteuse
� Chaque mécanisme fait l’objet d’études réalisées au moyen d’outils moléculaires
� Applications
� Surveiller le développement des souches résistantes
� Discriminer un échec thérapeutique d’une réinfection
Atelier Paludisme 2007
Mutations ponctuelles
Y268S/Ncyt bAtovaquone
Codon sauvage N86
� Nb copies gène mdr1 > 1
mdr 1Mefloquine, Quinine,
Halofanthrine, Lumefantrine
N86Y, Y184F, S1034C, N1042D, D1246Ymdr 1
C72S, M74I, N75D/E, K76T, A220S,
Q271E
crtChloroquine
A16V, S108T
ou N51I, C59R, S108N, I164L
dhfrProguanil, Chlorproguanil
N51I, C59R, S108N, I164L
ou C50R, N51I, S108N, I164L
dhfrPyriméthamine, Trimethoprim
S436A/F, A437G, K540E, A581G,
A613S/T
dhpsSulfadoxine, Dapsone
Remplacement acide aminRemplacement acide aminéé induit par induit par
une mutation ponctuelleune mutation ponctuelleGGèène ne
ciblciblééAntipaludiqueAntipaludique
Mutations ponctuellesMutations ponctuelles
PCR en temps finalPCR en temps final
� Principe d’une réaction de PCR
� AS PCR � RFLP PCR
� SSOPDIG PCR ELISA
Alifrangis et al. (2005). Am. J. Trop. Med. Hyg. 72(2); pp. 155–162
NZILA-MOUNDA, A. et al.
(Jan. 1998). Antimicrobial
Agents and Chemotherapy.
p. 164-169
DURAISINGH, M.T. et al.
(1998).
Exp Parasitol. 89;1-8
Mutations ponctuellesMutations ponctuelles
PCR en temps rPCR en temps rééelel
� Principe � SYBR Green I
� Sondes d’hydrolyse Taqman � Sondes d’hybridation
Mutations ponctuellesMutations ponctuelles
SSééquenquenççageage
� Pyroséquençage� Séquençage direct
Zhou et al. (2006). J Clin Microbiol. 44(11); p 3900–3910.
Pyrosequencing, a High-Throughput Methodfor Detecting Single NucleotidePolymorphisms in the DihydrofolateReductase and Dihydropteroate SynthetaseGenes of Plasmodium falciparum
2.28 USDPyroséquençage
3.66 USDSéquençage
direct
6.58 USDRFLP
Coût
/échantillon/SNP
Mutations ponctuellesMutations ponctuelles
DNA ChipsDNA Chips
BRYANT et al. (2004). Lancet Infect Dis 2004; 4: 100–111
Mutations ponctuellesMutations ponctuelles
PCRPCR--RFLP RFLP PfPf. DHPS K540E. DHPS K540E
M
ndd
D’après Mbugi et al. (2006).
Malaria Journal, 5:94. p 1-11
Mutations ponctuellesMutations ponctuelles
PCR temps rPCR temps rééel el PfPf. DHFR S108N. DHFR S108N
Thermocycleur
temps réel
(TaqMan 48
Roche)
Extracteur d’acides
nucléiques (MagNA Pure
Compact Roche)
Laboratoire de biologie – Centre Hospitalier de Mayotte D’après une adaptation du protocole de Alker et al. (2004). Antimicrobial Agents and Chemotherapy, p. 2924–2929
Amplification gAmplification gééniquenique
PCR temps rPCR temps rééel el -- PfPfmdrmdr--11
� SYBR Green I / Taqman
� Gènes de référence présents à 1 ou plusieurs copie(s)
� Souche Pf. à tester vs. souche Pf. contrôle
� Méthode du ∆∆CT
� Nb de copies relatif
= 2−∆∆CT=2 −( (CTER-CTEC)-(CTBR-CTBC) )
� R: gène de référence
� C: gène cible
� E: souche à tester
� B: souche de référence
Exemple: Price et al. (2004). « Mefloquine resistance in Plasmodium falciparum and
increased pfmdr1 gene copy number ». Lancet. 364; p 438-47
Illustration: C. GIRY – Centre Hospitalier de Mayotte
Atelier Paludisme 2007
ActivitActivitéé transcriptionnelletranscriptionnelle
PCR temps rPCR temps rééel el -- PfPfmdrmdr--11
Quantification relative
� SYBR Green I
� Gènes de référence
(housekeeping genes) dont
l’expression n’est pas affectée par
l’antipaludique.
� Méthode du ∆∆CT
Echantillon
Extraction d’ARN
DNase I
Purification ARNm
cDNA synthesis
Random priming
OligodT priming
Sp. primer priming
Real time PCR
Real time PCR
1-step qRT-PCR
2-step qRT-PCR
Stratégie
Optimisation
� Volume d’échantillon
� dNTPs, Mg2+ / Mn2+
� Concentration en primers
� t°et temps d’annealing/extension
� Efficacité de l’amplification
Atelier Paludisme 2007
Applications (I)Applications (I)
Surveillance de la propagation des rSurveillance de la propagation des réésistancessistances
Chloroquine Pyriméthamine Sulfadoxine
D’après Jelinek et al.(2002). Malaria Journal. I:II; p 1-7
Atelier Paludisme 2007
Applications (II)Applications (II)
Discriminer rDiscriminer rééinfection infection vs.vs. recrudescencerecrudescence
� Recrudescence témoigne d’un échec thérapeutique précoce ou tardif
� Utilisation de marqueurs polymorphiques
�Msp1, Msp2, Glurp
�Microsatellites
Atelier Paludisme 2007
ConclusionsPerspectives
Quantification
d’ARNm
PCRTEMPSREEL
Amplification
génique
Génotypage
RFLP Séquençage
DélétionVariants d’épissage
Détection / Quantification absolue de pathogènes
Translocation
Réarrangement
Références� ALIFRANGIS, M. et al. (2005). « A Simple, High-Throughput Method to Detect Plasmodium
falciparum Single Nnucleotide Polymorphisms in the Dihydrofolate Reductase, DihydropteroateSynthase, and P. Falciparum Chloroquine Resistance Transporter Genes Using Polymerase Chain Reaction and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay-Based Technology ». Am. J. Trop. Med. Hyg. 72(2); p. 155–162
� BERRY, A. et al. (2006). « Prevalence of Plasmodium falciparum cytochromeb gene mutations in isolates imported from Africa, and implications for atovaquone resistance ». Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 100; p 986-988
� DURAISINGH, M.T. et al. (2005). « Contribution of the pfmdr1 gene to antimalarial drug-resistance ». Acta Tropica. 94; p 181–190
� HYDE, J.E. (2002). « Mechanisms of resistance of Plasmodium falciparum to antimalarial drugs ». Microbes and Infection. 4; p165-174
� HYDE, J.E. (2005). « Drug-resistant malaria ». TRENDS in Parasitology. 21(11); p 494-498� JONES, P.M. et al. (2005). « Multidrug resistance in parasites: ABC transporters, P-glycoproteins
and molecular modelling ». International Journal for Parasitology. 35 ; p 555–566� LE BRAS, J. et al. (2006). « Les résistances aux médicaments antipaludiques ». Médecine et
maladies infectieuses. 36 ; 401–405� MBUGI, E.V. et al. (2006). « Drug resistance to sulphadoxine-pyrimethamine in Plasmodium
falciparum malaria in Mlimba, Tanzania”. Malaria Journal. 5(94) ; p 1-11� PLOWE, C.V. (2003). « Monitoring antimalarial drug resistance: making the most of the tools at
hand ». The Journal of Experimental Biology. 206; p 3745-3752� PRICE, R.N. et al. (2004). « Mefloquine resistance in Plasmodium falciparum and increased
pfmdr1 gene copy number ».Lancet. 364; p 438–47� RANDRIANARIVELOJOSIA M. et al. (2006). « First evidence of pfcrt mutant Plasmodium
falciparum in Madagascar ». Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 100; p 826-830
� WILSON, P.E. et al. (2005). « Real-time PCR methods for monitoring antimalarial drug resistance ». TRENDS in Parasitology. 21(6); p 278-283
� WOODROW, C.J. et al.(2006). « Antimalarial drugs: recent advances in molecular determinants of resistance and their clinical significance ». Cell. Mol. Life Sci. 63 ; p 1586–1596
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