Tests in vitro pour évaluer la sensibilitéde P. falciparum aux drogues

par

Marie-Ange Rason, MD

7ème édition du cours international “Atelier Paludisme”08 Avril 2009 – Institut Pasteur de Madagascar

…, il est impératif de surveiller la

sensibilité/résistance de Plasmodium sp aux

antipaludiques, notamment dans les pays

d’endémie.

Test in vivo(traitement et suivi)

Echantillon de sang

Tests in vitro

Evaluation de la sensibilité de P. falciparum aux antipaludiques

Test de chimiosensibilité

Génotypage (marqueurs de

résistance)

4

Test de chimiosensibilité in vitro

Mise en culture des parasites

viables

MicroscopiqueOMS, CTD/MAL/97.20 Rev. 2 2001

Colorimétrique (pLDH, HRPII)Moreno et al. Med Trop 2001; 61:545-57Noedl et al. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46:1658-64Noedl et al. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49:3575-3577

Isotopique (hypoxanthine tritiée)Desjardins, Clin Pharmacol Ther 1979; 26:327-29Le Bras, Am J Trop Med Hyg 1983; 32: 447-51

Cytométrie en fluxPattanapanyasat et al. Cytometry 1997; 27: 84-91

Microfluorimetrique (PicoGreen, Sybergreen)Corbett et al. Am J Trop Med Hyg 2004; 70:119-24Smilkstein et al. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48:1803-1806Bennet et al. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48: 1807-1810M.A. Rason et al. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2008; 102, 346-351

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Tests de chimiosensibilité in vitro

MicroscopiqueOMS, CTD/MAL/97.20 Rev. 2 2001

Colorimétrique (pLDH, HRPII)Moreno et al. Med Trop 2001; 61:545-57Noedl et al. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46:1658-

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Isotopique (hypoxanthine tritiée)

Desjardins, Clin Pharmacol Ther 1979; 26:327-29Le Bras, Am J Trop Med Hyg 1983; 32: 447-51Cytométrie en fluxPattanapanyasat et al. Cytometry 1997; 27: 84-91

Microfluorimetrique (PicoGreen, Sybergreen)Corbett et al. Am J Trop Med Hyg 2004; 70:119-24

Cycle biologique des plasmodies infectant l’homme

Cycle biologique des plasmodies infectant l’homme

Contraintes logistique et technique (communes)

• isolats (souches de parasites provenant des malades)

• Équipements de laboratoire

• Personnel compétent

• Bonnes pratiques de laboratoire

• Clones de référence de P. falciparum (3D7, FCM29, D6 …)

Procédure:Randrianarivelojosia et al, 2002Le Bras & Deloron, 1983

Plasmodium falciparum (synchronisé)

Préparation de la suspension parasitaire dans du RPSH 10%(200µl par puits sur plaque de 96 puits; 0,5% de parasitémie; 1,5% d’hématocrite; hypoxanthine tritiée 0,4 µCi/puits) Incubation 42h à 37°C (atmosphère microaérophile et humide) Evaluation de la radioactivité incorporée et calcul desCI50

Conduite du test isotopique in vitro

Plaques de culture

à 96 puits, à fond plat,

pré médicamentées

Exemple de drogues :ChloroquineMonodesethyl-AQQuinineDihydro-artémisinineMéfloquine

Conduite du test isotopique in vitro

Modular Incubator Chamber

Billups-rothenberg

Mise en culture

Incubation pendant 42h à37°C; atmosphère humide;en microaérophilie

Congélation

Décongélation des plaquesde culture

Conduite du test isotopique in vitro

Salle de collecte, collecteur et filtre en fibre de verre

Schématisation de l’incorporation de l ’hypoxanthinetritiée dans l’ADN du parasite (Base purine: A-G)

+

Hypoxanthine-3H

ADN plasmodial (début du test) ADN marqué

au tritium

Compteur à scintillation liquide piloté par ordinateur

. Comptage de la radioactivité en coups/mn(cpm) à l ’aide du Microbeta

. Calcul des CI50 (concentration inhibitrice 50%) en nanomolaire (nM)

. Seuil resistance: chloroquine (100 nM), monodesethylamodiaquine (60 nM) , quinine (800 nM).

Disposition et concentration des molécules en nanomolaire (nM) dans la plaque

vert = Témoin négatif (puits sans médicaments)

Faibleconcentration

Forteconcentration

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A 12,5 12,5 2,5 2,5 25 25 0,25 0,25B 25 25 25 5 5 5 50 50 50 0,5 0,5 0,5C 50 50 50 10 10 10 100 100 100 1,25 1,25 1,25D 100 100 100 20 20 20 200 200 200 2,5 2,5 2,5E 200 200 200 40 40 40 400 400 400 5 5 5F 400 400 400 80 80 80 800 800 800 10 10 10G 800 800 160 160 1600 1600 20 20H 1600 1600 320 320 3200 3200 40 40

CQ MAQ Q DHA

TDD01

Résultats du comptage de radioactivité pour un test de chimiosensibilité in vitro de P. falciparum

vert = Témoin négatif (puits sans médicaments)

Faibleconcentration

Forteconcentration

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A 13819 13626 14042 13988 14141 14103 12061 12252 14425 11577 11489 14374B 13276 12774 14926 15296 15550 14952 8243 7737 7353 8487 6670 8765C 6373 5763 5547 12805 13048 12214 4816 5046 4912 1125 845 1106D 859 1015 1112 880 914 1062 2916 2381 2746 700 479 672E 549 593 549 417 392 444 1104 1250 1333 529 555 520F 553 478 477 496 390 402 496 592 643 583 457 1015G 567 485 13177 820 638 13372 746 766 12513 12014 466 1077H 521 587 11900 783 635 11898 782 1210 11944 11444 700 495

CQ MAQ Q DHA

TDD01 TDD01 TDD01 TDD01

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Test de chimiosensibilité in vitro

Mise en culture des parasites

viables

MicroscopiqueOMS, CTD/MAL/97.20 Rev. 2 2001

Colorimétrique (pLDH, HRPII)Moreno et al. Med Trop 2001; 61:545-57Noedl et al. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46:1658-64Noedl et al. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49:3575-3577

Isotopique (hypoxanthine tritiée)Desjardins, Clin Pharmacol Ther 1979; 26:327-29Le Bras, Am J Trop Med Hyg 1983; 32: 447-51

Cytométrie en fluxPattanapanyasat et al. Cytometry 1997; 27: 84-91

Microfluorimetrique (PicoGreen, Sybergreen)Corbett et al. Am J Trop Med Hyg 2004; 70:119-24Smilkstein et al. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48:1803-1806Bennet et al. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48: 1807-1810Rason et al. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2008; 102, 346-351

SYBR Green I is a DNA- intercaling dye that prefers G and C base pairs.

formule chimique: C32H37N4S - cyanines asymétriques (fluorophores)Excitation is at 488nm and emission at 510 to 550

Mise en culture des parasites. Plaque prémédicamentée. Lavage 3x avec RPMI-1640 . RPSH 10% sans hypoxanthine tritiée. Parasitémie à 0.5%, hématocrite à 1,5% . Incubation 72 h à 37°C, atmosphère microaérophile et humide. Congélation plaque

lecture:. Décongeler les plaques pendant 2 H au moins à température ambiante(RT) . Transférer 100 µL de la suspension parasitaire dans une plaque vierge. Préparer mix: 0,2µL/ml de Sybr Green avec tampon lyse MSF (Malaria Sybr Green fluorescence). Ajouter 100µL/puits de ce mix dans la suspension parasitaire. Incuber 30 mn à RT, à l’abri de la lumière. Lecture 485/535 nanomètre au fluorimètre

Méthode avec Sybr Green (fluorophore)______________________________________________

Méthode isotopique Méthode avec Sybr Green

Plaque prémédicamentée Plaque prémédicamentée

Suspension parasitaire + hypox-3H

Incubation culture (72H)Incubation culture (42H)

Suspension parasitaire

Transfert sur filtre

Séchage filtre

Rajout liquide scintillant

scellé

Compteur à scintillation liquide

Transfert 100µL+ rajout Tp Lyse MSF avec Sybr Green

Incubation 30mn

Lecture / Fluorimètre

Fluorimètre

Table 1: Comparison of the isotopic and SYBR Green I measurements for clinical isolates of P. falciparum tested against four drugs______________________________________________________________________________________________________________

Drug tested No. isolates Geometric mean (nM) [95%CI] P-valuea αcb

tested ___________________________________Isotopic assay [3H]- SYBR Green Ihypoxanthine

_________________________________________________________________________________________________

50% inhibitory concentrationChloroquine 138 20.2 [16.5-27.7] 22.3 [18.7-26.7] 0.46 0.93Monodesethylamodiaquine 138 7.6 [6.6-8.8] 7.2 [6.3-8.3] 0.61 0.92Quinine 135 48.7 [40.6-58.4] 52.3 [44.7-61.3] 0.56 0.90Dihydroartemisinine 130 0.80[0.65-0.97] 0.80[0.65-0.96] 0.99 0.81

90% inhibitory concentrationChloroquine 138 116.6[98.0-138.8] 119.4[102.3-139.5] 0.84 0.68Monodesethylamodiaquine 138 32.9[28.8-37.7] 35.5[30.8-40.8] 0.45 0.73Quinine 135 342.1[296.7-394.4] 335.8[287.7-391.9] 0.86 0.72Dihydroartemisinine 130 4.4[3.8-5.1] 4.6[3.95-5.46] 0.66 0.58

____________________________________________________________________________________________________________

a Significances by Mann-Whitney U tests are given for the difference in inhibitory concentrations measured with the two assays.b Concordance coefficient correlation.

Correlation between individual IC50s (in nM) for chloroquine determined by the SYBR Green I and the isostopic assays(n=541; r = 0.93, CI95% 0.92-0.94) P< 0.0001

0,01 0,1 1 10 100 1000

1000

100

10

1

0,1

0,01

Log IC50 SYBR Green I

Log

IC50

isot

opic

Avantages et Inconvénients_________________________________________________

Méthode isotopique Méthode avec Sybr Green

. Radioélément . Fluorophore

. Référence . Simple

. Radioprotection . Rapide

. Personne compétente . très sensible

. Compteur à scintillation . Fluorimètre

. Incubation 42H . Incubation 72H

. Résultats en cpm . RFU(Relative Fluorescence Units)

. 50$ par plaque 96 puits . 0,88$ par plaque 96puits

Conclusion avec méthode Sybr Green

Préférable d’utiliser cette méthode avec: signal coût

Son utilité dans le test de chimiosensibilité: idéal pour un screening avec un grand nombre

d’échantillons approprié pour comparer avec un autre méthode faisable sur le terrain

Tests in vitro pour évaluer la sensibilitéde P. falciparum aux drogues

par

Marie-Ange Rason, MD

7ème édition du cours international “Atelier Paludisme”08 Avril 2009 – Institut Pasteur de Madagascar