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Tests Tests in vitro in vitro pour pour é é valuer la sensibilit valuer la sensibilit é é de de P. falciparum P. falciparum aux drogues aux drogues Marie Ange Rason Marie Ange Rason Atelier Paludisme Atelier Paludisme 6eme 6eme é é dition dition 10 Mars au 18 Avril 2008 10 Mars au 18 Avril 2008 Ministère de la Santé, du Planning Familial et de la Protection Sociale Madagascar

Tests in vitro pour évaluer la sensibilité de P.falciparum aux drogues

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Tests Tests in vitroin vitro pour pour éévaluer la sensibilitvaluer la sensibilitéé

de de P. falciparumP. falciparum aux droguesaux drogues

Marie Ange RasonMarie Ange Rason

Atelier Paludisme Atelier Paludisme –– 6eme 6eme ééditiondition10 Mars au 18 Avril 200810 Mars au 18 Avril 2008

Ministère de la Santé, du Planning

Familial et de la Protection Sociale

Madagascar

…, il est impératif de surveiller la

sensibilité/résistance de Plasmodium sp aux

antipaludiques, notamment dans les pays

d’endémie.

Test Test in vivoin vivo(traitement et suivi)(traitement et suivi)

Echantillon de sang Tests in vitro

Evaluation de la sensibilitEvaluation de la sensibilitéé de de P. falciparumP. falciparum aux antipaludiquesaux antipaludiques

Test de Test de chimiosensibilitchimiosensibilitéé

GGéénotypagenotypage(marqueurs de (marqueurs de rréésistance)sistance)

4

Test de chimiosensibilitTest de chimiosensibilitéé in vitroin vitro

Mise en culture Mise en culture des parasites des parasites

viablesviables

MicroscopiqueMicroscopiqueOMS, CTD/MAL/97.20 OMS, CTD/MAL/97.20 RevRev. 2 2001. 2 2001

ColorimColoriméétrique (trique (pLDHpLDH, HRPII), HRPII)Moreno et Moreno et alal. . MedMed Trop 2001; 61:545Trop 2001; 61:545--5757NoedlNoedl et et alal. . AntimicrobAntimicrob Agents Agents ChemotherChemother 2002; 46:16582002; 46:1658--6464NoedlNoedl et et alal. . AntimicrobAntimicrob Agents Agents ChemotherChemother 2005; 49:35752005; 49:3575--35773577

Isotopique (Isotopique (hypoxanthinehypoxanthine trititritiééee))Desjardins, Clin Desjardins, Clin PharmacolPharmacol TherTher 1979; 26:3271979; 26:327--2929Le Bras, Le Bras, AmAm J Trop J Trop MedMed HygHyg 1983; 32: 4471983; 32: 447--5151

CytomCytoméétrietrie en fluxen fluxPattanapanyasatPattanapanyasat et et alal.. CytometryCytometry 1997; 27: 841997; 27: 84--9191

MicrofluorimetriqueMicrofluorimetrique ((PicoGreenPicoGreen, , SybergreenSybergreen))Corbett et al. Am J Trop Med Hyg 2004; 70:119-24

Smilkstein et al. AntimicrobAntimicrob Agents Agents ChemotherChemother 2004; 48:18032004; 48:1803--18061806

BennetBennet et et alal. . AntimicrobAntimicrob Agents Agents ChemotherChemother 2004; 48: 18072004; 48: 1807--18101810

M.A. M.A. RasonRason et et alal. . TransTrans R Soc Trop R Soc Trop MedMed Hyg.Hyg. 2008; 102, 3462008; 102, 346--351351

5

Tests de chimiosensibilitTests de chimiosensibilitéé in vitroin vitro

MicroscopiqueMicroscopiqueOMS, CTD/MAL/97.20 OMS, CTD/MAL/97.20 RevRev. 2 2001. 2 2001

ColorimColoriméétrique (pLDH, HRPII)trique (pLDH, HRPII)Moreno et Moreno et alal. . MedMed Trop 2001; 61:545Trop 2001; 61:545--5757NoedlNoedl et et alal. . AntimicrobAntimicrob Agents Agents ChemotherChemother 2002; 46:16582002; 46:1658--

6464

Isotopique (hypoxanthine Isotopique (hypoxanthine trititritiéée)e)

Desjardins, Clin Desjardins, Clin PharmacolPharmacol TherTher 1979; 26:3271979; 26:327--2929Le Bras, Le Bras, AmAm J Trop J Trop MedMed HygHyg 1983; 32: 4471983; 32: 447--5151CytomCytoméétrietrie en fluxen fluxPattanapanyasatPattanapanyasat et et alal.. CytometryCytometry 1997; 27: 841997; 27: 84--9191

MicrofluorimetriqueMicrofluorimetrique ((PicoGreenPicoGreen, , SybergreenSybergreen))Corbett et al. Am J Trop Med Hyg 2004; 70:119-24

Cycle biologique des plasmodies infectant Cycle biologique des plasmodies infectant ll’’hommehomme

Cycle biologique des plasmodies infectant Cycle biologique des plasmodies infectant ll’’hommehomme

Contraintes logistique et technique (communes)Contraintes logistique et technique (communes)

•• Clone de parasitesClone de parasites

•• ÉÉquipements de laboratoirequipements de laboratoire

•• Personnel compPersonnel compéétanttant

•• Bonnes pratiques de laboratoireBonnes pratiques de laboratoire

•• Souches de rSouches de rééfféérence de rence de P. falciparum P. falciparum ((3D7, FCM29, 3D7, FCM29, D6 D6 ……))

Questionnements : Questionnements : -- laboratoires rlaboratoires réégionaux en Afrique ?gionaux en Afrique ?-- collaborations collaborations sudsud--nordnord ??

ProcProcéédure:dure:

Randrianarivelojosia et Randrianarivelojosia et alal, 2002, 2002Le Bras & Le Bras & DeloronDeloron, 1983, 1983

Plasmodium falciparumPlasmodium falciparum (synchronis(synchroniséé))

PrPrééparation de la suspension parasitaire dans du RPSH paration de la suspension parasitaire dans du RPSH 10%(20010%(200µµl par puits sur plaque de 96 puits; 0,5% de l par puits sur plaque de 96 puits; 0,5% de parasitparasitéémie; 1,5% dmie; 1,5% d’’hhéématocrite; hypoxanthine tritimatocrite; hypoxanthine tritiéée 0,4 e 0,4 µµCiCi/puits)/puits)Incubation 42h Incubation 42h àà 3737°°C (atmosphC (atmosphèère micro are micro aéérophile et rophile et humide)humide)EvaluationEvaluation de la radioactivitde la radioactivitéé incorporincorporéée et calcul dese et calcul desCI50CI50

Conduite du test isotopique Conduite du test isotopique in vitroin vitro

Plaques de culturePlaques de culture

àà 96 puits, 96 puits, àà fond plat, fond plat,

prpréé mméédicamentdicamentéées es

Exemple de drogues :Exemple de drogues :

ChloroquineChloroquineMonodesethylMonodesethyl--AQAQQuinineQuinineDihydroDihydro--artartéémisininemisinine

Conduite du test isotopique Conduite du test isotopique in vitroin vitro

Modular Incubator Chamber

BillupsBillups--rothenbergrothenberg

Mise en cultureMise en culture

Incubation pendant 42h Incubation pendant 42h àà3737°°C; atmosphC; atmosphèère humide; re humide; en en microamicroaéérophilierophilie

CongCongéélationlation

DDéécongcongéélation des plaques lation des plaques de culturede culture

Conduite du test isotopique Conduite du test isotopique in vitroin vitro

Salle de collecte, collecteur et filtre en fibre de verreSalle de collecte, collecteur et filtre en fibre de verre

SchSchéématisation de lmatisation de l’’incorporation de lincorporation de l ’’hypoxanthinehypoxanthinetrititritiéée dans le dans l’’ADN du parasiteADN du parasite

+

Hypoxanthine-3H

ADN plasmodial ADN plasmodial (d(déébut du test)but du test) ADN marqué

au tritium

Compteur Compteur àà scintillation liquide pilotscintillation liquide pilotéé par ordinateurpar ordinateur

. Comptage de la radioactivit. Comptage de la radioactivitéé((cpmcpm) ) ààll ’’aide du aide du MicrobetaMicrobeta

.. Calcul des Calcul des CI50 CI50 (concentration (concentration inhibitrice 50%)inhibitrice 50%)

. . SeuilSeuil resistanceresistance ::chloroquinechloroquine (100 (100 nMnM), ),

monodesethylamodiaquinemonodesethylamodiaquine (60 (60 nMnM) , ) ,

quinine (800 quinine (800 nMnM).).

RRéésultats du comptage de radioactivitsultats du comptage de radioactivitéé pour pour

un test de chimiosensibilitun test de chimiosensibilitéé in vitroin vitro de de P. falciparumP. falciparum

vert = Témoin négatif (puits sans médicaments)

Faibleconcentration

Forteconcentration

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A 13819 13626 14042 13988 14141 14103 12061 12252 14425 11577 11489 14374

B 13276 12774 14926 15296 15550 14952 8243 7737 7353 8487 6670 8765

C 6373 5763 5547 12805 13048 12214 4816 5046 4912 1125 845 1106

D 859 1015 1112 880 914 1062 2916 2381 2746 700 479 672

E 549 593 549 417 392 444 1104 1250 1333 529 555 520

F 553 478 477 496 390 402 496 592 643 583 457 1015

G 567 485 13177 820 638 13372 746 766 12513 12014 466 1077

H 521 587 11900 783 635 11898 782 1210 11944 11444 700 495

CQ MAQ Q DHA

TDD01 TDD01 TDD01 TDD01

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Test de chimiosensibilitTest de chimiosensibilitéé in vitroin vitro

Mise en culture Mise en culture des parasites des parasites

viablesviables

MicroscopiqueMicroscopiqueOMS, CTD/MAL/97.20 OMS, CTD/MAL/97.20 RevRev. 2 2001. 2 2001

ColorimColoriméétrique (trique (pLDHpLDH, HRPII), HRPII)Moreno et Moreno et alal. . MedMed Trop 2001; 61:545Trop 2001; 61:545--5757NoedlNoedl et et alal. . AntimicrobAntimicrob Agents Agents ChemotherChemother 2002; 46:16582002; 46:1658--6464NoedlNoedl et et alal. . AntimicrobAntimicrob Agents Agents ChemotherChemother 2005; 49:35752005; 49:3575--35773577

Isotopique (Isotopique (hypoxanthinehypoxanthine trititritiééee))Desjardins, Clin Desjardins, Clin PharmacolPharmacol TherTher 1979; 26:3271979; 26:327--2929Le Bras, Le Bras, AmAm J Trop J Trop MedMed HygHyg 1983; 32: 4471983; 32: 447--5151

CytomCytoméétrietrie en fluxen fluxPattanapanyasatPattanapanyasat et et alal.. CytometryCytometry 1997; 27: 841997; 27: 84--9191

MicrofluorimetriqueMicrofluorimetrique ((PicoGreenPicoGreen,, SybergreenSybergreen))Corbett et al. Am J Trop Med Hyg 2004; 70:119-24

Smilkstein et al. AntimicrobAntimicrob Agents Agents ChemotherChemother 2004; 48:18032004; 48:1803--18061806

BennetBennet et et alal. . AntimicrobAntimicrob Agents Agents ChemotherChemother 2004; 48: 18072004; 48: 1807--18101810

Rason et Rason et alal. . TransTrans R Soc Trop R Soc Trop MedMed Hyg.Hyg. 2008; 102, 3462008; 102, 346--351351

SYBR Green I is a DNA- intercaling dye that prefers G and C base pairs.

formule chimique: C32H37N4S - cyanines asymétriques (fluorophores)

Excitation is at 488nm and emission at 510 to 550

Mise en culture des parasites. Plaque prémédicamentée. Lavage 3x avec RPMI-1640 . RPSH 10% sans hypoxanthine tritiée. Parasitémie à 0.5%, hématocrite à 1,5% . Incubation 72 h à 37°C, atmosphère microaérophile et humide. Congélation plaque

lecture:. Décongeler les plaques pendant 2 H au moins à RT . Transférer 100 µL de la suspension parasitaire dans une plaque vierge. Préparer mix: 0,2µL/ml de Sybr Green avec tampon lyse MSF(Malaria Sybr Green fluorescence). Ajouter 100µL/puits de ce mix dans la suspension parasitaire. Incuber 30 mn à RT, à l’abri de la lumière. Lecture 485/535 nm au fluorimètre

MMééthode avec thode avec SybrSybr Green (Green (fluorophorefluorophore))____________________________________________________________________________________________

Méthode isotopique Méthode avec Sybr Green

Plaque prémédicamentée Plaque prémédicamentée

Suspension parasitaire + hypox-3H

Incubation culture (72H)Incubation culture (42H)

Suspension parasitaire

Transfert sur filtre

Séchage filtre

Rajout liquide scintillant

scellé

Compteur à scintillation liquide

Transfert 100µL+ rajout Tp Lyse MSF

avec Sybr Green

Incubation 30mn

Lecture / Fluorimètre

Table 1: Comparison of the isotopic and SYBR Green I measurements for clinical isolates of P. falciparum tested against four drugs

______________________________________________________________________________________________________________

Drug tested No. isolates Geometric mean (nM) [95%CI] P-valueaαcb

tested ___________________________________

Isotopic assay [3H]- SYBR Green I

hypoxanthine

_________________________________________________________________________________________________

50% inhibitory concentration

Chloroquine 138 20.2 [16.5-27.7] 22.3 [18.7-26.7] 0.46 0.93

Monodesethylamodiaquine 138 7.6 [6.6-8.8] 7.2 [6.3-8.3] 0.61 0.92

Quinine 135 48.7 [40.6-58.4] 52.3 [44.7-61.3] 0.56 0.90

Dihydroartemisinine 130 0.80[0.65-0.97] 0.80[0.65-0.96] 0.99 0.81

90% inhibitory concentration

Chloroquine 138 116.6[98.0-138.8] 119.4[102.3-139.5] 0.84 0.68

Monodesethylamodiaquine 138 32.9[28.8-37.7] 35.5[30.8-40.8] 0.45 0.73

Quinine 135 342.1[296.7-394.4] 335.8[287.7-391.9] 0.86 0.72

Dihydroartemisinine 130 4.4[3.8-5.1] 4.6[3.95-5.46] 0.66 0.58

____________________________________________________________________________________________________________

a Significances by Mann-Whitney U tests are given for the difference in inhibitory concentrations measured with the two assays.b Concordance coefficient correlation.

Correlation between individual IC50s (in nM) for chloroquinedetermined by the SYBR Green I and the isostopic assays(n=541; r = 0.93, CI95% 0.92-0.94) P< 0.0001

0,01 0,1 1 10 100 1000

1000

100

10

1

0,1

0,01

Log IC50 SYBR Green I

Lo

g I

C5

0 i

soto

pic

Avantages et Inconvénients_________________________________________________

Méthode isotopique Méthode avec Sybr Green

. Radioélément . Fluorophore

. Référence . Simple

. Radioprotection . Rapide

. Personne compétant . très sensible

. Compteur à scintillation . Fluorimètre

. Incubation 42H . Incubation 72H

. Résultats en cpm(coups/minutes) . RFU(Relative Fluorescence Units)

. 50US$par plaque 96 puits . 0,88US$ par plaque 96puits

Fluorescence-based assays: conclusions

Of published methods, SYBR Green I/MSF assay is preferable on the basis of signal, flexibility and cost

Optimization likely to be ongoing and sometimes site-specific

Unequivocal utility as a drug testing method– Ideal for high-throughput screening– Appropriate for side-by-side comparisons– Feasible for field use