40

Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle

���������������� ��������

�� ������� ������� �������

�������

� � �������������������������������������������� ����� �

� ������ ��� �

Page 2: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle

������ � ������������ � ������

�� ����� ���� �� ����� ����

� ������ ����

���� � �� ��� ���

� ������ ����

���� � �� ��� ����������� �������

� ��������� ���

�������� �������

� ��������� ���

����������������������������������������������

Page 3: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle

������������������������ ������������!

���������� � �"���� ����������������� ��������� ��������������� ������ ����������� ��������� ���������������#�

� �!�! ����� ����� �������� ����������������� ����������� �������������"���������� � ���#�

���� �� �����������!������ � ����� �����������$�����"$����������������������� ������

���������������� �����������%����������������������

� � �!������� ����������� ���������������������������� ��������� ���

Page 4: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle

��� �����������!������ � ���" �!�! ���

# �� �!���$��� � ���%�&'(��)������*������ � ������+%�

,����������-����%�&'.��������� �����/���������� ��

0 ���������� �1 ����� �2 �����%�&'34���* �!�! ��� +����/�� �� � �5)����

6�7�8 ���� /%��������6�������� �0 ������� ��%�4994���!��:�� �7������!������������" ��� �;������� �<��������� �� �����������!������ � ��=�

���� �� �!������ � ���5�� �!�� ����� ����� ��������7�������������������

Page 5: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle

�&'

� �

� �

(�) '�����* �������

� +

� ,

���-

. � �/

� � ��'0102

� � ��3

4�� � � ��3

���������� �

4���� ��5 ��������� ��5 ���

6 � ���7���������������������

��� ������! ��

. ������

∆∆∆∆��

� � ��8

45

� � $>%�?� $

Page 6: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle

9 ������9 ������

/# :� ��������+��� � ��������;�

4� ������� ���� ����!

-# 9 ��������������� ����� ����� ���� �+�

���� �����!

'# 9 ���������� ��� ������� ������� ��

��������������� ��� ���������

������ ������!

Page 7: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle

. ����������;������������� ���

/88<=�> ����������� � ����"�

� ���+��������������"� ������������ �������" �������������� ������ �� ����������������������� ������������� ������ ������������" ���� ��

? #�@� �

Page 8: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle

4���������� ���������4� ����� !

���� ����

. �� ���������"���� ����������

. ���� � �� � ��"����� ������

����������� ����� ��� ���� ����

�������������������� ��� !� �� " ���� ��#��� �� $������ ����

A �����=�B �����-CC-

chloroquine camptothecinetrophozoites daunomycine

Page 9: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle

. ������ ��4� ������� ���� ���

D� "���� �����. 6 B �E> F B @:G

@+���� �� ���������� ���������

A ����� ��������������������������� �

? ��������

4����������

Page 10: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle

� @ � A�

,B�?

5 µm

A �!����� C49�D

������<����C4E�D������<����C49�D

1) TUNEL (Terminal dUTP Nick End Labelling): Fragmentation

internucléosomale de l’ADN

Page 11: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle

PI

�����������

74A H

C� '� <3�

10%

5% 14%

24% 25%

39%

@+������������� ���� ����� ��. ���+��� ��0�4H

trophozoïtesSSC

FSC

schizontes

Page 12: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle

���� 6 #�D ���,=�B �����-CC<

%�� &

3) Marquage par l’Annexine V:

Exposition phosphatidylsérines

@+������������� ���� ����� ��. ���+��� ��0�4H

Page 13: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle

���� ������ �����

74A H

�����������

���4

A ��������� ������� ���������� �EI � /G

'�

��

��

(�

)�

*�

+�

,�

-�

. ��������/����

0�1 2

���������

����

Page 14: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle
Page 15: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle
Page 16: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle
Page 17: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle

Stratégie de Recherche

Approche biochimique in vitro

• Synthèse de protéine recombinante

• Tests d’activité enzymatique avec substrat luminescent

Approche in vivo dans cellule eucaryotes

• Test de surexpression et d’induction d’apoptose

• Test de clivage

Approche in vivo chez P.falciparum

• Test d’activité enzymatique et de clivage après induction d’apoptose!

• Test de survie du parasite en présence d’inhibiteurs de Caspase

Approche bioinformatique

• Recherche d’un gène candidat

• Recherche de site catalytique

• Recherche de domaines

Page 18: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle

Approche bioinformatique

P20 P10

H C

Domaine catalytique C14

D D

Site de clivage potentiel

CARDDD DED26 72

75 106

211 242

Domaines régulateurs

P20

P10

Métacaspase inactivée

Métacaspase activée

Page 19: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle

���� �

������������������������ � ���

����

�� � !"#����$�

�� � !"#����%�

�#�!&�" #�� !��

�'����(��('��

���������������������� � ���

����

�� � !"#���$�

�����$��

���)�*+ ,��

�'����(��('��

������������������� � ���

����

. ������ ��� �� "����+������

��!�+"#-!��-

. .� �"�

+ �� � !"#�

+ ���/0� 1 ��#�"�,"2

�3�0�".�!1�

��4

Page 20: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle

9 ��������� ����� ����� ���� �+����� �����!

etoposide sur 7g8 48 h

0

20

40

60

80

100

120

0 3,75 7,5 15 30 60

etoposide (µg.mL)

%

ring

tropho

schizontes

pycno

etoposide sur 3d7 48 h

0

20

40

60

80

100

120

0 3,75 7,5 15 30 60

etoposide (µg.mL)

%

ring

tropho

schizontes

pycno

Page 21: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle
Page 22: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle

. ������ � ��" ���� ���

+3, 4 �5+

����� � ��� '--+� 6��#0� ���� 6���� 1 �$���

���������

Page 23: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle

9 �������� ������� ������� ����������������� ��� ��������������� ������!�

Page 24: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle
Page 25: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle
Page 26: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle

�"1 0�����!-�

� ������������. ����"�����5

-�!���.� ����"#��#�!� #�����0� 1�. .� �"��

-����-!�"#��"����1"����� 6��� !-�&��!��0!�

-!�"#������&��1�"

Page 27: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle

��" #

'���7��� �������8 ���#����������� �# ������

7 9����������� �� �#�����:

��2#����� #���; 8 ��������� ��� ���� �# �#��#�7� ��� �

�������� ������ �� �� ����� 7��� �����

8 2#����� ���7�� 8 ���# ���� �� �� �������� ���#���� �� �<��� ��

����!�� ���� �= ������#�#

8 >��#�� �� ���# ���#���� ����# ���������� �� �#�� ���# � ��

���7��

��?�����������! ����# ��! 7 #���##����� �#�

Page 28: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle

'����� . "��"#/'��2

7 ��1� . "��"��� 9���0�� �

7 '��+'�����:.�����-�"#������� ��#��"#�!-"#��6"-#��;�

&�"#;�����;�1!���;��#- ���"����<

7 ����..� ��-�0 ������1�#�� 0���� #"��#�1"

Page 29: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle

'���"#����&�"#

7 1�<�� #��# �� ���������8

8 $���������#� ����� ���#��� ������ ���7���� ��7���

�������� ���#� �#������#@

7 >�� ������#8

8 ?���#� ���������� �#������#� ��7��� �������� ���#�

����@

7 0������ 7� �������8

8 $������ �����7� ������ ' A$2B�'C

8 $����������� �����! ���� #���#� 6?B@

7 ������# ��#� ��������� �� ����� �������� ���#

�� ���# �# � ����������������

Page 30: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle

9 E � . 3

�61 F0 �� ���

B=�7������ 1 � �1

?B���&9. !����� ��

�������� ����� E���������������=����������J G

ABG ABG ABG

������

�� � �����5�

�8 ABG %�?B���9H�F-��I�&49�@ ?F� ���

J9

������ ������

B����� ��� ��%�,�� 7���� ����� ��� %�� ����

&E 4&

6�����5��� �����5�:��

6�����,� 1 ��: ��� ���

�I.9

�I&4

�I&4

� G ������� �:�K �7�����IJ9

Page 31: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle

��������� "#0����-1"���!��"�� #�� ����'��

��!�����!���""� ����� ���� ����������������

�������- ��

!IG =G G &.

Page 32: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle

��������� "#0����-1"���!��"�

. ��#�"� #0 !#-"#�0�� ��

��������� "#0����-1"���!��"�

. ��#�"� #0 !#-"#�0�� ��

��-"#.��"��1"

"#�����-&��9��#��+�4�

=���0 -

��-"#.��"��1"

"#�����-&��9��#��+�4�

=���0 -

��-"#9�"��� ��

&��9��#��+�4�=�

�3$>

��-"#9�"��� ��

&��9��#��+�4�=�

�3$>

��-"#��-& -���

��&��9��#��+�4�=�

?�3$>

��-"#��-& -���

��&��9��#��+�4�=�

?�3$>

Page 33: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle

'��'��

� #�� � #��

8 B�"� ����� 7���� ��� ������ ��� 3�!�� ��5�� ����

����&�!1����&�!1 � ���:� ���: �!#��!#�

����� 7����499�H�

Page 34: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle

'���+ '����+ ��.����+��.����

1����:.����" #

��E

��3

��E

��3

��E

��3

��E

��3

��� ����� ��� C���� 7���D�" ABG � ��� �� � ��� C7���-�7���D

Page 35: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle

��� 6"#���1����:.����" #�"#�&�"#

'��'��

� #�� � #��

'��'��

� #�� � #��

Page 36: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle

��� �:��� �: 6����6����

NS

� ����5�� ��

��� ��� ABG

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

� ����5�� ��

��� ��� ABG

NS

�"��"� :"-��"��"� :"-�

Page 37: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle

(!11��

?3 '���-����-����0� 1�����&��1�"�"#��1!�"#�1 -�

�3 '���-��������&�"#�"#011� ������. #���� �"#0���" #�/���;�

���;���2

�3 '���.����#�����1 �������"#�����&�"#

���!�����!��?3 ����#��� 0�1!�"#��1 -�

�3 . .� �"�&#��

�3 �#- 1"@�-� #�� �-�"#"���"�

�3 � �� 0����1�#�

?3 ����#��� 0�1!�"#��1 -�

�3 . .� �"�&#��

�3 �#- 1"@�-� #�� �-�"#"���"�

�3 � �� 0����1�#�

>����������� ������# ��� ���� ���� �����

��7��� �������� D��#� � ���� ����� �� �������#

5�#�##� ���*

Page 38: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle

������ � ������������ � ������

�� ����� ���� �� ����� ����

� ������ ����

���� � �� ��� ���

� ������ ����

���� � �� ��� ���

�������� �������

� ��������� ���

�������� �������

� ��������� ���

G ������ � F�J9��������G ������ � F�J9��������

�. .� �"� 0����1�"�.� � @ #;���1 -"!1�&�����"5��. ��"&��1���#"�1 0 ��"1"�"#�"#��#�"�� 0�"#0���" #�"#����1 � !"� 3��+��#����;��#�3�A3�.��"� ??��+??��

�. .� �"�����-� ������ � !"#����#�"�"�"�� 0�����!1#1�"�.��"�����1 -"!1�0�".�!13��"� ��?%%4;���#�3�� �3�( �3��� .3���-���$%�+$%?3

B ���(�����?;�A�;�?4�5�%��+�%3�����C'�������;��"#�':.�11 ?�45?$?+?$43���������������A��;�?�45?���+%�3�'#- ���"��

Page 39: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle

. ������ ���� �����������

���������������"����

. ������ ���� �����������

���������������"����

Page 40: Vie et mort de Plasmodium : la place de l'apoptose au cours du cycle

B������ � � ��!�! ��������������!������� � LB������ � � ��!�! ��������������!������� � L

�������6�������6���M �������

����� ������ ��

��������������1 ���"���� 6������0 ��� ��$�������/� ��7� �6��� 1 ����� A�-��

$������<��������7�������� � ���6� ����

� � ������A���� ���� ���������# �������6���

1 � ������ �:���

A1 �J3J4

# ��������� ������ ��������B���� ����

$��� � �����������

����

@ �,��� ,�

N,�����: ��7���%��7� �� � ������ �<��

� �!�����!� ������� ���7�����

A1 �J3J4A1 �J3J4

# ��������� ��# ��������� ������� ��������B���� ������� ��������B���� ����

$��� $��� �� ����������������������

��������

@ �,��� ,�@ �,��� ,�

NN,�����:,�����: ��7�����7���%�%��7� �� ��7� �� � ������������ �<�� �<��

� �� �!�����!� �������!�����!� ������� �����7�����7������